基于铜绿假单胞菌群体感应系统的潜在抗菌中草药筛选研究

高 磊，童浩文，梁跃辉，赵弘毅，刘海波，刘 旭

1广西大学医学院新药筛选中心；2广西大学化学化工学院，南宁 530004

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)与多种感染有关[1]。近期研究发现在抗生素治疗时，PA的耐药性通过群体感应增强[2]。近年来，由于抗生素的广泛使用，PA对多种抗菌药物产生耐药性，使得临床PA感染的治疗难度大幅增加。寻求抑制耐药PA的新药物成为全球亟待解决的问题。鉴于我区中医药资源丰富，本课题考虑从中药出发，以群体感应的关键蛋白作为靶点。利用分子对接的方法，在中药化合物库中搜索与活性位点亲和力较高的配体分子。借助抑菌试验对虚拟筛选结果验证，寻找临床上可抑制PA耐药的中草药，以配合抗生素联用。

而群体感应(quorum sensing，QS)是细菌群体协调毒力表达的胞间通讯系统[3]。机制为五点[4-6]：(1)外排泵基因过表达；(2)灭活酶使药物水解；(3)生物被膜形成；(4)作用靶点突变；(5)外膜通透性下降。

PA的群体感应系统至少包含4个子系统[7]：假单胞菌喹诺酮信号(Pseudomonasquinolone signal，PQS)，综合群体感应信号(integrated quorum sensing signal，IQS)以及LAS和RHL系统。因此，与传统抗生素相比，群体感应系统抑制剂(quorum sensing inhibitors，QSIs)可减弱PA的毒性，降低耐药性避免败血症，提高抗生素治疗的敏感性。

QS系统间相互作用如图1、2所示。LAS系统的胞间信号分子为2-庚基-3-羟基-4-喹诺酮(3-oxo-C12-HSL)，可正向调节PQS系统；RHL系统的胞间信号分子为N-丁酰基-高丝氨酸内酯(C4-HSL)，可以负向调节PQS系统[8]。

图1 铜绿假单胞菌QS系统主要信号分子结构式

图2 铜绿假单胞菌QS系统之间的相互作用

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验中草药

选取常见中草药，共计2 733个，然后记录各味中草药的多个活性成分，汇总。画出活性分子的结构式并优化和保存其立体构型，建立小分子库，为后续的分子对接做准备。实验中使用的部分中草药见表1。实验中使用的部分中草药种属鉴定情况见表2。本文药材鉴定人是广西国际壮医医院民族药研究所所长黄瑞松教授。

表1 实验中使用的部分中草药

续表1(Continued Tab.1)

表2 实验中使用的部分中草药种属鉴定表

1.1.2 涉及蛋白质

从蛋白质数据库(RCSB Protein Data Bank，http://www.rcsb.org/)中确定PA群体感应系统相关的重点蛋白，以PDB.格式保存。分别是以PDB号5EOE为代表的BEL-1型蛋白[9]；以4HEF为代表的AmpC型蛋白[5]；以4ZZL为代表的外排泵操纵子抑制因子[4]；以4NR0为代表的烯基还原酶[2]；以3H78为代表的喹诺酮类生物合成酶[10]。这些是多篇文献已发现并反复提及的群体感应关键蛋白，对应本文所述的五个群体感应PA耐药机制和耐药系统间级联调控[11]。

1.1.3 主要仪器及设备

HJ-VD-650型洁净工作台(上海苏净实业有限公司)；722G型可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)； DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)； ZHWY-2 102型双层恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；D1 008型高速微量离心机(京君龙实验仪器(北京)有限公司)；Vortex-Genie2型涡旋混合器(美国 scientific industries公司)；TGL-16M型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；DRP-9 032型电热恒温培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；JY92-IIL型超声波细胞破碎机(上海皓庄仪器有限公司)；DHG-9 007A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；DYCZ-24N型电泳仪(北京六一仪器厂)；WD-2012A型自动酶标仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.1.4 主要试剂

LB肉汤、技术琼脂粉(北京陆桥技术有限公司)；氯化钠(天津市科密欧化学试剂有限公司)；Tris、Giycine、SDS(北京Solarbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 分子对接

本工作采用Molecular Operating Environment(MOE 2015)软件，DELL R640商用服务器(20 CPU，DDR 2 666)为软硬件基础。先对上述5个蛋白进行预处理，步骤为先质子化，再优化蛋白质三维结构将体系能量降低，最后删除非键合水分子，加氢等。预处理后的蛋白质与中草药活性分子依次对接。MOE软件计算工作在中科院上海有机所进行，该软件的优点是可以将蛋白和小分子配体进行准确高效地虚拟对接。

以每个活性化合物改变100次空间构型和靶标对接，使用配体扩张法获得活性位点，采用柔性对接的方法，对接运行次数每个1 000次。根据多次对比各个打分函数后，确定以London dG为打分函数S(Score)最为适宜。因其能较好表征柔性对接前后体系吉布斯自由能的微小变化值，从而在热力学角度解释配体与受体的结合强弱。对接计算结束，按S从低到高排序查看。根据打分值，筛选配体分子，S的数值越低，说明此配体与此蛋白质作用活性越高，此配体小分子成为铜绿假单胞菌QSIs的潜力越大。

1.2.2 耐药性分析方法

取59株适量的冻存耐药PA菌种，分别接种到50 mL的离心管中(含有20 mL的LB液体培养基)，在37 ℃、120 r/min的条件下培养12 h。之后从中取适量菌液接种到新的50 mL离心管中(含20 mL的LB液体培养基)，在37 ℃、120 r/min的条件下培养12 h，待用。另外，准备1株野生菌PAO1，留存备用。

2 结果和分析

2.1 对接结果与分析

将上文所提5个蛋白质跟配体小分子进行对接，MOE计算后，得到17个的优秀小分子配体(见表3)，对应得到7个代表性中草药，它们分别为：五倍子、苎麻根、羊蹄甲、火炭母、叶下珠、水松、多花野牡丹。其中，部分药物活性成分和靶蛋白的对接过程，见图3所示。

续表3(Continued Tab.3)

图3 蛋白质和部分配体小分子之间的3D分子对接图

以5EOE和没食子酸辛酯为例，由图3可知，没食子酸辛酯分子占据了雪茄型疏水性口袋，与周围的基酸残基相互作用。其中除了疏水作用，谷氨酸残基(Glu-A84)和苏氨酸残基(Thr-A111、Thr-A113)通过溶剂中的水分子，与酚羟基形成间接氢键。这些作用力使得配体与5EOE亲和力高，结合力较强，表现出较不错的对接得分。

QSIs可以在不影响细菌生长的同时，抑制其毒力的形成，达到抗感染的目的。分子对接表明，代表中草药小分子有能力和PA中的群体感应通路关键蛋白形成复合物，与它们的内源性配体竞争，降低耐药性。有望成为潜在的铜绿假单胞菌QSIs。从而可大致推断出，含较丰富此类小分子的中草药，或可直接用于PA耐药株，甚至应用于临床中药伍配，与抗生素联用降低耐药株的活性，提高疗效。

2.2 中草药抑菌试验

对59株临床耐药菌株和1株野生菌PAO1进行了药敏分析显示60株铜绿假单胞菌对阿莫西林、氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、头孢西丁、呋喃妥因、复方新诺明和替加环素是完全耐药的；而对野生株PAO1敏感的抗生素有头孢哌酮、氨曲南、头孢他啶、庆大霉素、左氧氟沙星、妥布霉素以及他唑巴坦(见表4)。通过抗生素药敏试验的结果，选出一株抗药性最强的菌株(#5336)和一株抗药性最弱的菌株(#5685)作为中药抑菌试验的研究对象。

表4 60株铜绿假单胞菌药敏实验分析数据

为验证上述计算结果的准确性，进行了抑菌试验和中草药筛选。

使用药敏片法和牛津杯法[12]对2 733种中草药抑菌效果进行筛选，如图4所示。以抑菌圈的出现为判定依据，发现五倍子、牡丹等中草药对耐药PA均有明显的抑菌作用，筛选结果见表5。

图4 纸片法(左两纸)和牛津杯法(右两纸)筛选试验结果示例图(#5336、#5685菌株)

表5 2 733种中草药抑菌筛选结果

五倍子(Gall Chinensis)的主要成分为没食子酸酯类、黄芩苷类、蒽醌类和槲皮素等，其中含量最高的为没食子酸酯类。其中没食子酸辛酯和5EOE的对接得分最低，说明没食子酸辛酯是耐药通路关键蛋白对接打分较优异的小分子。火炭母(Polygonumchinense)为蓼科植物。其主要化学成分为黄酮、酚酸、挥发油及甾体类，有较好的抑菌活性。Ouyang等[13]对此做过测试，结果显示，火炭母的抑菌活性物质存在于叶和茎中，且叶中提取液抑菌活性更高。其中邻苯二甲酸、3,3′-二甲基鞣花酸、山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷与4ZZL、5EOE相关通路蛋白对接打分更低，对接效果更好，说明上述成分很可能是真正发挥作用的主要药效成分。叶下珠(Phyllanthusurinaria)又名珍珠草、阴阳草，属于大戟科植物。其主要化学成分可大致分为黄酮类、鞣质类、有机酸类、香豆素类、木质素类、多糖类等。其中phyllanthusiin A跟4HEF对接的打分最低，说明和该蛋白的对接效果更好，有望成为铜绿假单胞菌QSIs的潜在药物。苎麻根、水松、多花野牡丹、羊蹄甲的作用与上述类似。

3 讨论与结论

PA耐药问题日趋严重，这对临床上抗菌药物的治疗效果造成较大困扰。QS系统在多种细菌尤其PA中普遍存在，系统间呈级联调控，调控细菌的致病性和耐药性。与传统抗生素相比，QSIs可以在不影响细菌正常生长的前提下，仅在适当浓度时对靶细菌的QS系统产生抑制作用，降低细菌的毒力，以抑制细菌毒素扩散[14]。本文所用的5个蛋白分别对应不同的通路蛋白。其中5EOE是BEL-1型蛋白，可生产灭活酶来破坏β-内酰胺环，导致该类抗生素失活；4HEF是头孢菌素水解酶复合物，归属于群体感应LAS子系统，其通过形成一个类β-内酰胺酶的共价结合酶复合物，来抑制丝氨酸β-内酰胺酶，从而为其广谱抑制性能提供结构基础[15]；4ZZL是MexR-R21W的突变体，是铜绿假单胞菌MexAB-OprM多药外排泵操纵子的抑制因子，其中DNA结合损害突变导致多药耐药[16]。4NR0是为PA产生的一种enoyl-ACP还原酶，在毒力因子3-oxo-C12HSL的合成中发挥重要作用。3H78是喹诺酮类假单胞菌信号生物合成酶突变体与邻氨基苯甲酸酯组成的复合物，是该菌体内生物合成的重要催化剂[17]，抑制该复合物可降低PQS系统毒力因子的产生，降低耐药性。

近年来，有研究表明，一些临床常用药物也具有QSIs活性。如阿司匹林作为传统的解热镇痛药被发现在6 mg/mL浓度时不影响PA的生长，同时对QS毒力因子(如弹性蛋白酶、绿脓菌素等)产生一定的抑制作用[18]。驱虫药氯硝柳胺可以抑制PA毒力因子的产生以及生物膜的形成。除此之外，一些人工合成的药物也具有QSIs的性能。例如，以呋喃酮((5Z)-4-溴-5-(溴亚甲基)-3-丁基-2-(5H)-呋喃酮)为原型的人工合成衍生物，呋喃酮C-30能够抑制外排泵和毒力因子的表达，增加PA生物膜对抗生素的敏感性[19]。但目前为止，这些研究几乎都只停留在实验室范畴，临床活性还有待进一步研究。

本文借助MOE软件，对2 733个常见中药材的活性成分进行虚拟筛选，得到了7种可能有耐药株抑制作用的中草药：五倍子、苎麻根、羊蹄甲、火炭母、叶下珠、水松、多花野牡丹。随后，对其进行相关抑菌验证，结果与分子对接的计算结果吻合，说明本次筛选具有一定合理性。本研究采用的计算机虚拟筛选法，具有成本低、效率高的特点。在传统药理实验中结合计算，可更高效率进行研究。但值得一提的是，有些中药在虚拟计算中没有得到，却在实际筛选中显出抗菌活性(如盐肤木、西青果、诃子等)，说明本方法仍然相对粗放，存在偏差和遗漏，还需进行改进。后期拟采用分子动力学模拟，分析体系的运动性以及抑制机理等重要科学问题。

关于本文筛选出的中草药，Chen等[20]观察到在一定情况下，五倍子对PA生物膜有一定的清除作用，甚至是完全清除；Song等[21]发现中药材火炭母提取物对PA的生长有一定的抑制作用，且其最低抑菌浓度为15.63 mg/mL；Pandey等[22]通过体外抑菌试验发现，羊蹄甲(叶、茎皮及花)的提取物对PA有一定的抑菌作用。

本文的另一个目的是提供临床上应对抗生素耐药的PA感染。现正与临床科室进行合作，以筛选出的中药为各个单方，煎煮后与阿莫西林、头孢他啶、左氧氟沙星进行联用，观察其治疗效果，取得一定进展。但临床中医师反馈提及，需较强效的中药复方，以期更好地预后。虽然大部分化合物处于生物活性研究或临床前研究阶段，进入临床试验阶段的化合物还比较少，未来还将具有很多的不确定性，但这些具有不同作用机制的化合物为研发人员提供了宝贵的经验和研究思路，使得新型抗菌药物的出现成为可能。QSIs拥有良好的应用前景，并且目前已报道的QSIs还很有限，很有必要去研究真正适合人类使用的安全高效的QSIs，解决医学上细菌耐药性这一难题。