益肾固本膏方对肾阳虚哮喘模型大鼠肾上腺皮质类固醇合成酶及糖皮质激素受体亚型的影响*

王云方

无锡市中医医院，江苏 无锡 214000

支气管哮喘发病率逐年上升，严重危害患者健康，而频繁的急性发作必将导致患者肺功能进一步恶化，长期、反复、大量的应用糖皮质激素产生的毒副作用对人体的影响广泛且严重。临床研究发现，肾虚（主要为肾阳虚）常贯穿支气管哮喘发生发展的全过程，其成因既有先天禀赋的影响，也有疾病反复发作带来的损伤，还有长期应用糖皮质激素的副作用。补肾类中药可有效改善哮喘患者“肾虚”的病理状态。

益肾固本膏方是无锡市名中医壮健的经验方，具有温补肾元、填精益髓、理虚祛痰之疗效，前期临床及实验研究发现，益肾固本膏方可增加肾阳虚哮喘模型大鼠血浆中促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、皮质酮（corticosterone，CORT）的释放，支气管哮喘缓解期患者使用益肾固本膏方可减少激素使用量及急性发作的次数，同时减轻发作时咳嗽、气喘严重程度，疗效显著，且未见不良反应［1］。

曾洋等［2］通过基因表达谱分析发现自拟补肾阳复方能提高多种类固醇合成酶如HSD11B1、CYP7A1 的表达；Western blot 亦显示HSD11B1 蛋白表达升高，提示提高类固醇合成酶的表达可能是补肾阳复方升高肾阳虚证模型血浆皮质酮水平的机制之一。由此我们推测益肾固本膏方通过促进肾上腺皮质类固醇合成酶表达而增加内源性皮质酮释放，另外，益肾固本膏方增强激素效应可能与促进GRα 表达、同时抑制GRβ表达相关。本研究通过建立肾阳虚哮喘大鼠模型，测定肾上腺组织中HSD11B1、CYP11B1 及肺组织GRα、GRβ表达，以期发现益肾固本膏方减少支气管哮喘急性发作次数并增强激素效应的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁型SD大鼠，40只，雄性，2月龄，体质量（270±20）g，由江苏省血吸虫病防治所动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（苏）2017-0050。饲养条件：分笼饲养于江苏省血吸虫病防治所动物饲养室（清洁Ⅱ级）饲养，自由饮水，室温（20±2）℃，湿度55%～65%，定期紫外线消毒，通风良好。

1.2 实验药物益肾固本膏方主要组成：熟地黄、山萸肉、山药、淫羊藿、菟丝子、枸杞、肉桂、白芍、党参、黄芪、黄精、苏子、法半夏、穿山龙、陈皮、降香、炙甘草等，最后以鹿角胶、阿胶、冰糖熬制收膏总剂量3780 g，终浓度相当于每1 mL 含生药3.53 g，由无锡市中医医院煎药室煎制，置于4℃冰箱中备用。

1.3 试剂与仪器注射用氢化可的松琥珀酸钠（湖北人民制药有限公司，批号：H20058653）；卵蛋白、AlOH3凝胶（Sigma公司，卵蛋白批号：O1641，AlOH3凝胶批号：1017502）；PCR 反应试剂盒（TAKARA 公司，批号：RR091A）；HSD11B1 兔抗多克隆抗体（蓝基公司，批号：AF3397）；CYP11B1抗多克隆抗体（Santa Cruz 公司，批号：SC-374096）；GRα 兔抗多克隆抗体（Abcam 公司，批号：ab3580）；GRβ兔抗多克隆抗体（Biorbyt 公司，批号：orb314758）；Western BlotⅡ抗（Abcam 公司，批号：ab6721）；NE-C900型雾化机（Omron公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 造模及分组 大鼠适应性喂养2 天后，采用随机数字表法将40 只大鼠分为空白对照组，模型对照组，益肾固本膏方低、中、高剂量组，每组8只。1）空白对照组腹腔注射生理盐水1 mL（只/天）；模型对照组及益肾固本膏方各剂量组制备肾阳虚哮喘大鼠模型，腹腔注射氢化可的松琥珀酸钠25 mg/（kg·d），连续20 天。2）实验第21、27天空白对照组分六点注射生理盐水2 mL（双侧腹股沟、背部皮下、双侧后足趾皮下、腹腔）；模型组分六点注射AlOH3及OVA 混合液2 mL。3）实验第34 天至实验第47 天，空白对照组予生理盐水雾化，模型组予10 g/L 卵蛋白雾化，各组每次给药30 min，隔日1 次，共7 次。4）造模成功表现：模型组大鼠体质量低于空白对照组，空白对照组大鼠毛发顺滑，体质量日渐增加，双目有神，反应、活动灵活敏捷，叫声响亮，大小便正常，正常进食饮水。模型组大鼠体质量增长缓慢，目光无神，易抓取，脱毛，拱背，蜷缩，抱团，自主活动减少，爪甲颜色变浅，饮食、饮水减少，大便清稀，多尿，出现竖毛、身体蜷缩、扎堆，眼睛半眯、小便次数多等现象，证实肾阳虚哮喘动物模型造模成功。

1.4.2 给药方法 造模成功后，空白对照组及模型对照组灌服蒸馏水2 mL（只/天），连续20 天。根据前期实验结果，分别予益肾固本膏方低、中、高剂量灌胃并经人与动物剂量换算标准确定大鼠灌胃剂量。益肾固本膏方低、中、高剂量组分别灌服益肾固本膏方2.15、10.73、21.45 g/（kg·d），连续20天。

1.4.3 标本处理 灌胃结束后（给药最后一次16 h 后），称取大鼠体质量，采用3%戊巴比妥钠溶液（45 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，心脏取血后在冰面上迅速剪开胸腔，分离出肾上腺及肺组织，制备成组织匀浆用作检测HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβmRNA及蛋白表达。

1.5 观察指标

1.5.1 RT-PCR测定大肾上腺组织HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβmRNA 设计并合成引物：获取大鼠HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβ相关检测指标的基因序列，基因引物序列及其相关参数见表1。提取肾上腺组织HSD11B1 RNA、CYP11B1 RNA 及肺组织GRαRNA、GRβRNA测定浓度鉴定质量后，每组取1µg RNA逆转录为cDNA，20 µL 反应体系，将反转录条件设置为37℃15 min和85℃5 s，进行RT-PCR反应，两步法扩增，最终结果由软件自动求出。

表1 基因引物序列

1.5.2 Western Blot测定大鼠肾上腺组织HSD11B1、CYP11B1 及肺组织GRα、GRβ蛋白的表达 用干净的剪刀将组织块剪碎，加400µL单去污剂裂解液（含PMSF）于匀浆器中，低温匀浆，裂解液移至1.5 mLEP管中，然后在4℃下，以离心半径5 cm，12 000 r/min离心5 min，取上清分装并置于-20℃保存。上样前用裂解液及上样缓冲液调整蛋白浓度，煮沸蛋白样品（10 min），使蛋白充分变性，蛋白上样量为40µg。分别在样品孔内加入样品及蛋白Marker。电泳条件：100 V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。PVDF 膜经甲醇处理15 s 激活后，将其与分离胶以100V 转膜1 h。用TBST 稀释的5%脱脂奶粉浸泡PVDF 膜，封闭1 h。用TBST 洗去多余奶粉后，将PVDF 膜与一抗孵育过夜（一抗用TBST 以1∶500 稀释）。用TBST 在室温下洗3 次，每次10 min以洗去多余的一抗。将PVDF膜与二抗（1∶4000）室温孵育1 h。同样的方法将多余的二抗洗去。将配置好的发光液均匀滴加至PVDF膜上，反应1～2 min进行显色。用医用X光胶片采集荧光信号。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠肾上腺组织HSD11B1、CYP11B1 mRNA及蛋白表达与空白对照组比较，模型对照组HSD11B1、CYP11B1 mRNA 表达偏低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。益肾固本膏方各剂量组HSD11B1、CYP11B1 mRNA表达均高于模型组（P＜0.01），HSD11B1 mRNA与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），CYP11B1 mRNA 表达高于空白对照组（P＜0.01）。见图1。HSD11B1、CYP11B1 蛋白表达结果显示，空白对照组＞益肾固本膏方各剂量组＞模型对照组。见图2。

图1 各组大鼠肾上腺组织HSD11B1、CYP11B1 mRNA比较

图2 各组大鼠肾上腺组织HSD11B1、CYP11B1蛋白表达电泳图

2.2 大 鼠 肺 组 织GRα、GRβ mRNA 及 蛋 白 表达GRα mRNA表达表现为益肾固本膏方中、高剂量组＞益肾固本膏方低剂量组＞空白对照组＞模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。GRβmRNA表达表现为空白对照组及益肾固本膏方各剂量组均低于模型对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；益肾固本膏方各剂量组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。模型对照组GRα表达最低，空白对照组GRα 表达最高，益肾固本膏方各剂量组GRα 表达介于两者之间。关于GRβ蛋白表达结果提示模型对照组GRβ蛋白表达＞益肾固本膏方低、中剂量组＞益肾固本膏方高剂量组＞空白对照组。见图4。

图3 各组大鼠肾上腺组织GFα、GFB mRNA表达情况

图4 各组大鼠肾上腺组织GFα、GFβ蛋白表达电泳图

3 讨论

哮病的发生为痰伏于肺，每因外邪侵袭、饮食不当、情志刺激、体虚劳倦等诱因引动而触发，素质不强，长期反复发作，久病体弱，伤及肾阳，摄纳失常，阳虚水泛为痰，上干于肺，另外肾虚命门之火不能上济于心，则心阳亦同时受累，甚至发生喘脱危候。朱丹溪云：“未发以扶正气为主，既发以攻邪气为急。”故哮喘以“发时治标，平时治本”为基本原则。平时应扶正治本，肾阳虚者以补肾为要，现代临床研究中，补肾治疗被广泛应用于支气管哮喘缓解期。

益肾固本膏方功效为温补肾元、填精益髓。在前期研究中，本课题组以本方干预肾阳虚哮喘模型组大鼠，发现其能够升高肾阳虚哮喘模型组大鼠血浆ACTH、CORT 含量，亦在临床实验中取得很好的疗效。

HSD11B1 是一种肾上腺皮质类固醇合成酶，广泛存在于肝脏、肾脏、脂肪和骨骼等各种组织中，它属于短链脱氢/还原酶蛋白超家族（SDR），为相对分子质量（Mr）为34 000 的糖蛋白，是糖皮质激素的关键代谢酶，可以催化糖皮质激素C11 位的酮基与羟基之间的氧化还原反应，使有生物活性的皮质醇与无活性11-脱氢皮质酮（以下简称皮质酮）相互转化［3］。

循环中糖皮质激素的主要形式是皮质醇，所有HSD11B1 通过双向转换作用调节机体局部糖皮质激素的水平和活性［4］。韩钧等［5］指出，短期应用糖皮质激素可以直接促进11β-羟基类固醇脱氢酶的表达，而长期应用糖皮质激素可以间接抑制11β-羟基类固醇脱氢酶的表达，我们此次实验也证实通过持续使用氢化可的松琥珀酸钠腹腔注射建立的肾阳虚哮喘大鼠模型HSD11B1 表达下降，皮质醇含量下降，临床表现为哮喘反复发作，激素使用效果欠佳。

通过益肾固本膏方干预肾阳虚哮喘模型大鼠，使得肾阳虚哮喘模型大鼠HSD11B1 表达增加，将细胞内的无活性的皮质酮还原成有活性的皮质醇，放大激素效应，改善肾阳虚哮喘患者发作的频次与症状。

人肾上腺皮质中皮质醇生成的最后一步依赖于CYP11B1，可分别催化11-去氧皮质醇及11-去氧皮质酮生成皮质醇和皮质酮，CYP11B1 在肾上腺束状带和网状带中的表达，是皮质醇和醛固酮生成的关键调节因子［6］。实验结果提示，益肾固本膏方低、中、高剂量组干预动物模型后均可使模型大鼠CYP11B1 表达增加，进一步促进动物体内产生皮质醇及皮质酮，从而改善大鼠肾阳虚状态，减少哮喘发作，减少外源性激素使用，进一步改善患者肺功能。

大量临床研究证实，补肾阳法治疗肾阳虚型哮喘无明显不良反应，在临床运用中，不仅可减少患者缓解期急性发作次数，在与外源性激素合用时，还可减少外源性激素使用量，增强激素效应。刘仁慧等［7］通过实验研究证实补肾药协同抗炎及抑制激素的副作用与影响GR 亚型及上调肺转录因子有关。糖皮质激素发挥主要需依赖与体内糖皮质激素受体的结合，内源性糖皮质激素受体主要有两种，其中GRα 包含777 个氨基酸，具有与激素结合的能力，可发挥激素正性效应，是生理条件下GR 的主要存在形式。GRβ 只有742 个氨基酸，缺乏完整的激素结合区，在体内无生物活性，但可竞争性抑制GRα 介导的转录活化以及在炎症反中诱发糖皮质激素抵抗［8-9］。支气管哮喘发作是体内多种炎症介质、细胞因子等共同作用的结果，而多种细胞因子以及激素治疗过程中激素本身对GRα 的下调、GRβ的上调作用等均可影响组织细胞对GC的敏感性［10-11］。

本研究同时测定了GRα 和GRβ 的表达，进一步探讨益肾固本膏方即补肾阳法协同抗炎、减轻副作用、增强激素效应的具体机制。首先，长期反复的使用糖皮质激素使得肾阳虚哮喘模型组大鼠GRα 受体表达下降、GRβ 受体表达上升，诱发激素抵抗，降低激素使用效果，益肾固本膏方干预后，与模型对照组相比，GRα 表达上调、GRβ表达下调，益肾固本膏方通过增加GRα 蛋白表达、抑制GRβ表达来发挥协同抗炎、减轻副作用、增强激素效应的作用。

益肾固本膏方是无锡市名中医壮健主任医师经验方，以该方为基础方，加减治疗各种哮喘，效果明显。方中以熟地黄、山萸肉、山药、淫羊藿、菟丝子、枸杞、肉桂等取右归丸之意温补肾元、填精益髓；黄芪、党参、白术、茯苓等补肺健脾；苏子、法半夏、穿山龙、陈皮、降香等兼以祛痰下气、止咳平喘；辅以阿胶、鹿角胶、冰糖等收膏，并进一步固本培元。全方益肾固本尤以补肾阳法为主兼以理虚祛痰。在疾病缓解期应用益肾固本膏方，可有效改善哮喘患者“肾虚”的病理状态，减少其哮喘急性发作的频率和严重程度，并在支气管哮喘急性发作时发挥协同抗炎、减轻副作用、增强激素效应的作用。