蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠BMD、E2及股骨头CYP450 的作用*

赵 军，李 昕，谢静华，师建平，常 虹

1 内蒙古自治区中医医院，内蒙古 呼和浩特 010020；2 内蒙古医科大学附属医院；3 内蒙古医科大学中医学院

中国古代蒙医籍中记载的传统蒙药蓝刺头（echinops latifolius），其味苦，性凉，效稀、柔、钝、轻，有固骨质、接骨愈伤、清热解毒，杀“粘”止痛等功效，主治筋骨折伤、骨伤热、刺痛、金创、疮疡等症［1］。本研究在前期研究［2-3］的基础上进一步探究蒙药蓝刺头对去卵巢大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）、血清雌二醇（estradiol2，E2）、股骨头中芳香化酶P450（aromatase cytochrome P450，CYP450）作用，阐述蓝刺头对绝经后骨质疏松症的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物5 月龄雌性Wistar 大鼠105 只，购于内蒙古大学实验动物研究中心，实验动物合格证号：SCXK（蒙）2002-0001，标准饲料喂养，恒温、恒湿，购回大鼠环境适应7 天，开始制备动物去卵巢大鼠OP模型。

1.2 试药与试剂蒙药蓝刺头制剂原药购于内蒙古民族大学附属医院，由内蒙古国际蒙医医院制剂中心制备胶囊。强骨胶囊（北京岐黄制药有限公司，批号：131204，规格：0.25 g/粒）。己烯雌酚片（合肥久联制药有限公司，批号：20181120）。E2试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：201809213）；CYP450 试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：201809584）；DAB 显色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司，批号：1292345）；PBS 缓冲液（北京博奥森生物技术有限公司，批号：1321250607）。

1.3 实验方法90 只大鼠饲养适应7 天后按文献［4］制备PMOP 大鼠模型。依据文献［5-7］观察大鼠阴道涂片，确定造模是否成功。造模成功后大鼠阴道涂片均处于动情间期，成功复制PMOP 动物模型90 只；假手术组只切除卵巢周边脂肪，造模成功15 只。随机法将90 只PMOP 大鼠分为己烯雌酚组，强骨胶囊组，蒙药蓝刺头低、中、高剂量组，模型组6 组，每组15 只；另设假手术组15 只。药物各组分别研磨细碎，配制使用蒸馏水。据人、鼠体质量比及人、鼠代谢速率比行计算［3］，强骨胶囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL。蒙药蓝刺头高、中、低剂量组浓度依次为27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL，高、中、低剂量比例为4∶2∶1，其中低剂量组为临床有效剂量。为方便配药，上药计算为每日灌胃量0.02 mL/g，浓度配成。见图1。

图1 光镜下雌鼠阴道涂片（HE×400）

1.4 检测指标

1.4.1 标本采集 1）麻醉大鼠后心脏取血，在心尖搏动胸骨左缘处，粗针头斜向大鼠后背右上方向进针，深度约1.5 cm，防止吸抽过程中红细胞挤压溶血，保持速度缓慢均匀，采血5 mL，进行血清E2检测；2）处死大鼠剖取双侧完整股骨，分离干净附着的肌肉组织，保留完整骨膜，左侧股骨双能X线测BMD，4%甲醛液将右侧股骨浸没备免疫组织化学实验用；检测CYP450 在右侧股骨头中表达［5-10］。

1.4.2 检测影响骨代谢生化指标 采用显微CT（Micro-CT）对所有大鼠左侧股骨近端干骺端BMD计量学指标进行分析；采用酶联免疫反应法测定大鼠血清E2；行免疫组化染色观察肾上腺CYP450表达，每组大鼠取5 张切片（n0），每张切片随机选择5个视野（n1），在光学显微镜下观察各组染色情况。

1.4.3 大鼠股骨脱钙过程、免疫组化法染色观察 4%甲醛将大鼠右侧股骨固定10天，EDTA脱钙液配制，在1 000 mL 的烧杯中加入186 g EDTA-2Na·2H2O，189.4 g Na2HPO4、10.6 g NaH2PO4，加水约700 mL，将烧杯放置于加热搅拌器上并通电，NaOH 20 g 再入，搅拌加热至65℃，透明澄清液体颜色，测定调节溶液pH值为8.0，总量1000 mL定容。锥形瓶中移入大鼠右侧股骨，脱钙液EDTA 加入，液/骨体积比约4∶1，换液定时每2 日1 次，25℃左右室温，脱钙连续20 天，针尖刺入股骨，畅通无阻则完全脱钙。常规行免疫组化染色观察股骨CYP450表达［6］。

1.5 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 股骨骨密度BMD 水平假手术组，蒙药蓝刺头中、低剂量组，假手术组，强骨胶囊组，己烯雌酚组与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；蒙药蓝刺头高、低剂量组与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组与蒙药蓝刺头高剂量组比较，差异无统计学意义（P＜0.05）；蒙药蓝刺头中剂量组、强骨胶囊组、己烯雌酚组、假手术组组间两两相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠左侧股骨近端干骺端骨密度比较（±s） g/cm3

表1 各组大鼠左侧股骨近端干骺端骨密度比较（±s） g/cm3

注：与模型组比较，*表示P＜0.05；与假手术组比较，△表示P＜0.05

组别模型组假手术组蓝刺头高剂量组蓝刺头中剂量组蓝刺头低剂量组强骨胶囊组己烯雌酚组鼠数15 15 15 15 15 15 15 BMD 0.189±0.032△0.400±0.072 0.249±0.235△0.313±0.025*0.245±0.272*0.298±0.437*0.396±0.058*

2.2 血清E2水平与假手术组相比，模型组血清E2水平下降明显（P＜0.01）。与模型组相比，蓝刺头中、高剂量组，己烯雌酚组，强骨胶囊组血清E2水平均升高明显（P＜0.01）；蓝刺头低剂量组血清E2水平上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与己烯雌酚组比，蒙药蓝刺头中剂量组血清E2升高，蓝刺头高、低剂量组血清E2降低，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。与强骨胶囊组比较，蓝刺头中剂量组血清E2水平偏高，蓝刺头高、低剂量组血清E2水平偏低，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。蓝刺头高、中、低剂量组之间比较，蓝刺头中剂量组血清E2水平高于蓝刺头高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；蓝刺头低、中剂量组之间血清E2差异有统计学意义（P＜0.05），蓝刺头中剂量组血清E2表达提升明显。己烯雌酚组E2表达比强骨胶囊组高，但差异无统计学差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清E2水平比较（±s） pg/mL

表2 各组大鼠血清E2水平比较（±s） pg/mL

注：与假手术组比较，#表示P＜0.05；与模型组比较，△表示P＜0.05；与蓝刺头中剂量组比较，☆表示P＜0.05

组别模型组假手术组蓝刺头高剂量组蓝刺头中剂量组蓝刺头低剂量组强骨胶囊组己烯雌酚组鼠数15 15 15 15 15 15 15 E2 21.75±0.37#40.51±2.53 24.45±2.32△35.66±3.46△23.06±1.74☆29.05±2.29△29.94±2.56△

2.3 股骨头CYP450表达骨细胞组织切片显示：矮柱状、立方形的成骨细胞分布蓝刺头中剂量组比模型组明显增多；多核型破骨细胞蓝刺头中剂量组比模型组明显减少。表明蓝刺头中剂量组CYP450表达明显增高。见图2。

图2 各组大鼠股骨头CYP450表达（HE×400）

与假手术组相比，模型组右侧股骨头免疫组化CYP450 表达明显减弱（P＜0.01）。与模型组相比，己烯雌酚组，强骨胶囊组，蓝刺头中、高剂量组股骨头CYP450 均升高明显（P＜0.05）；蓝刺头低剂量组股骨头CYP450 升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。同己烯雌酚组比，蓝刺头中剂量组股骨头CYP450 升高，蓝刺头低、高剂量组CYP450 减少，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。同强骨胶囊组比较，蓝刺头中剂量组股骨头CYP450 升高，蓝刺头低、高剂量组CYP450 减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。蓝刺头中剂量组股骨头CYP450表达比高剂量组明显，但差异无统计学意义（P＞0.05）；蓝刺头低、中剂量组股骨头CYP450表达明显升高，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。强骨胶囊组股骨头CYP450 比己烯雌酚组高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠右侧股骨头CYP450表达比较（±s）µm2

表3 各组大鼠右侧股骨头CYP450表达比较（±s）µm2

注：与假手术组比较，#表示P＜0.05；与模型组比较，△表示P＜0.05；与蓝刺头中剂量组比较，☆表示P＜0.05

组别模型组假手术组蓝刺头高剂量组蓝刺头中剂量组蓝刺头低剂量组强骨胶囊组己烯雌酚组视野数25 25 25 25 25 25 25平均光密度值CYP450测定0.109±0.024#0.377±0.037 0.279±0.057△☆0.325±0.035△0.271±0.013△☆0.308±0.075△0.297±0.038△

3 讨论

植物来源的食物中，亚麻籽中木脂素的量最高，具有弱的雌激素和抗雌激素活性；木脂素的结构与他莫昔芬相似，有益于骨代谢［11-17］。DOYLE等［18］通过ERβ化学活性萤光素酶表达法研究了产自哥斯达黎加的17 种草药防治绝经后骨质疏松的作用及机制。结果发现6 种草药提取物可与雌激素结合，其中4 种草药可以刺激雌激素基因表达；6种草药能够调节MCF-7细胞内源基因表达，4种可用作雌激素激动剂，其中众香树和菝葜属植物主要通过增强雌激素调节蛋白pS2 mRNA 的表达、降低孕激素受体和PTGES mRNA 表达来发挥雌激素激动剂或拮抗剂作用，达到治疗围绝经期综合征、防治绝经后骨质疏松的目的。补肾、活血化瘀中药也含有植物雌激素，具有抑制骨吸收和促进骨形成的作用［19-21］。

综上所述，蒙药蓝刺头适当浓度具有类雌激素样作用；蓝刺头能增强股骨头CYP450 表达；蓝刺头适当浓度具有升高股骨头CYP450 产生的作用。本研究结果显示，蓝刺头与强骨胶囊效果相当，说明蓝刺头具类雌激素样作用，其优势体现在防治PMOP 方面，为蒙医药“补暖补精-清镇赫依-固骨质壮骨”理论提供实验依据。