黄连生物碱改善心力衰竭的网络药理学机制研究*

刘卓超，黄小靖，曾志聪

1 深圳市中医院,广州 深圳 518000；2 深圳市中西医结合医院；3 广州中医药大学附属宝安中医院

心力衰竭是多种原因导致心脏结构和/或功能的异常，使心室收缩和/或舒张功能发生障碍引起的一组复杂临床综合征，主要表现为呼吸困难、疲乏和液体潴留等［1］。根据流行病学研究［2］，我国人群的心衰患病率约为2%～3%，且随着年龄的增长，患病率有上升的趋势［3］，60岁以上患病率达到23%以上，严重影响人类健康。近年来研究［4-7］发现，黄连所含化学成分及其组方对心力衰竭具有治疗作用，其中黄连生物碱是黄连起效的重要成分，其作用机制尚未明确，本研究基于网络药理学探讨黄连生物碱治疗心力衰竭的机制，为黄连生物碱药理作用机制提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料来源本研究检索数据库包括：Uni-Prot（https：//www. uniprot. org/）、GeneCards（http：//www.gene-cards.org/）、String（http：//string-db.org/）、TTD（http：//bidd，nus，edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Metascape（http：//metascape.org/，Version 3.5）；软件包括：Cytoscape 3.7.1及Venny 2.1。

1.2 研究方法

1.2.1 黄连生物碱的靶点筛选 TCMSP 是一个中草药系统药理学平台，收录了中药、靶点和疾病之间的关联信息，该数据库包括化学成分、作用靶点和中药靶点网络，以及相关的药物靶点-疾病网络，以及关于口服生物利用度、药物相似性、肠上皮通透性、血脑屏障、水溶性等天然化合物的药代动力学特性的信息。利用TCMSP 数据库筛选中药黄连的化学成分，并筛选出黄连生物碱的化学成分及相关靶点信息，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和类药性（drug-likeness，DL）为筛选条件，设置OB≥30%和DL≥0.18，筛选出符合条件的生物碱化合物。再检索黄连生物碱的靶点，将获取信息输入UniProt 数据库中检索，筛选选择“Reviewed”，选择物种为“Human”，剔除非人源及未经验证的靶点，最终检索出黄连生物碱的基因靶点，通过Cytoscape 3.7.1 软件构建中药-成分靶点网络图。

1.2.2 心衰相关靶点的获取 以“heart failure”为关键词，检索TTD、GENECARDS 数据库中获取心衰的相关疾病靶点。

1.2.3 黄连生物碱对心衰相关靶点的获取 将“1.2.1”及“1.2.2”项下获取的黄连生物碱作用靶点及心衰相关靶点的信息使用Venny 2.1 工具进行交集对比，所得的重复靶点将视为黄连生物碱作用于心衰的预测靶点，并绘制韦恩图。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建及拓扑学参数分析 将“1.2.3”项下映射到的靶点导入STRING数据库，限定物种为“Homo sapiens”，设置置信系数为0.4，构建蛋白-蛋白相互作用网络的PPI 网络，导出网络数据nodel1、nodel2 和Combined score，利用Cytoscape3.7.1 软件构建PPI 网络，利用“Network Analyzer”计算靶点蛋白互作网络的拓扑学参数，参数如下：平均最短路径（average shortest path length，ASPL）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、中 心 接 近 度（closeness centrality，CC）、聚类系数（clustering coefficient，CC）、连通度（degree），设置节点大小与颜色反映连通度（degree）值大小，边的粗细反映Combined score 大小，最终获得蛋白质相互作用网络。

1.2.5 通路富集分析 运用R3.6.1使用Bioconductor 提供的分析和理解高通量基因组数据的工具，完成GO 基因富集分析，并绘制条形图，且进行KEGG通路分析，并绘制通路图。

2 结果

2.1 黄连生物碱的靶点筛选通过检索TCMSP数据库，以OB≥30%和DL≥0.18 为检索条件，从黄连中收集了6 个满足条件的生物碱成分，分别为coptisine、berberrubine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine，见表1。检索相关作用靶点，通过UniProt 的筛选及标准化，最终获得79 个作用靶点，通过Cytoscape 3.7.1 构建中药-成分靶点网络，见图1。

表1 黄连生物碱成分

图1 中药-成分靶点网络图

2.2 心衰相关靶点的获取以“heart failure“为关键词，经TTD 数据库、GENECARDS 数据库检索，共获取1614个结果。

2.3 黄连生物碱对心衰相关靶点的获取将“2.1”与“2.2”获取靶点通过Venny2.1 进行筛选，获取其中与黄连生物碱靶点有20 个重合，其中包括ESR1、CSNK2A1、PTGS1、ATP5F1A、EGFR、IFNG 等，约占合计总数的1.1%，见图2。

图2 心衰相关靶点及黄连生物碱靶点的韦恩图

2.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建及拓扑学参数分析将20个重叠的靶点上传String数据库，获取蛋白-蛋白相互作用网络。将String 数据库导出信息导入Cytoscape3.7.1 软件中，重叠的靶点相互作用见图3。重叠的靶点拓扑学分析，见表2。经Network Analyzer 分析网络拓扑学分析发现，该蛋白互作网络中节点数为16，边缘数为31，聚类系数为0.610，见图3。

表2 黄连生物碱对心衰作用靶点的拓扑学分析

图3 蛋白-蛋白相互作用网络图

2.5 通路富集分析

2.5.1 GO 注释分析 利用Metascape 的数据库，将20 个重叠的靶点进行GO 富集分析，设置阈值P＜0.01，minimum count 3、enrichmentfactor＞1.5，得到靶点的通路信息，见图4A—4B。GO 富集分析结果显示：生物学过程（biological pro-cess，BP）分析其P≤0.01 共331 条，涉及血液循环、血压调节、血管收缩、腺苷酸环化酶调节性G 蛋白偶联受体信号通路、儿茶酚胺分泌的负调控、G 蛋白偶联受体信号通路，儿茶酚胺转运等，见图5。细胞组件（cellular component，CC）分析P≤0.01 共有26 条，涉及基底外侧质膜、膜筏、受体复合体、突触膜的固有成分等，见图6。分子功能（molecular function，MF）分析P≤0.01 共有21 条，儿茶酚胺结合、G 蛋白偶联的胺受体活性、肾上腺素结合、神经递质受体活性、钙调蛋白结合等，见图7。

图4A 靶点的GO富集总分析

图5 BP分析

图6 CC分析

图7 MF分析

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通过Metascape 平台将筛选的黄连生物碱的活性靶点进行富集，得到靶点KEGG 通路信息，筛选出5 条直接与心力衰竭相关的信号通路，且对结果进行可视化，信号通路包括神经活性配体-受体相互作用（neuroacive ligand-receptor interaction）、钙信号通路（calcium signaling pathway）、cGMP-PKG 信号通路（cGMP-PKG signaling pathway）、HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）、cAMP 信号通路（cAMP signaling pathway）。见图8。

图8 KEGG富集分析图

图4B 靶点的GO富集总分析2

3 讨论

本研究是通过数据库和文献检索化合物、作用靶点以及疾病的靶点信息，通过构建网络通路可视化展示“药物-靶点-疾病”的方法，同时对网络中特性靶点在细胞、分子以及生物整体水平上的通路分析，从而预测药物治疗疾病的有效成分、相关靶点及作用机制等［8］。故通过网络药理学的方法，来探讨黄连生物碱治疗心力衰竭的有效成分、相关靶点及作用机制。

心力衰竭是心血管疾病的严重表现或晚期阶段，致残率及致死率居高不下，其常见病因分类有心肌病变、免疫及炎症介导的心肌损害、心脏负荷异常及心律失常等。目前认为影响心衰的关键因素是神经内分泌疾病导致心肌重构，进而出现心衰。目前对心衰的预防包括［1］：对危险因素的干预，包括长期有效的控制血压、血脂、血糖，筛查高危人群；干预无症状性左心室收缩功能障碍。西药临床治疗心衰主要通过利尿、强心、扩张冠状动脉等治疗方式，达到拮抗心肌重构的目的。

黄连作为常用的中药，首载于《神农本草经》，其味苦，性寒，归心、脾、胃等经，《日华子本草》记载：“治五劳七伤，益气，止心腹痛。惊悸烦躁，润心肺，长肉，止血……”现代研究表明，其含有生物碱、木脂素、香豆素、黄酮、萜类等多种化合物，具有抗氧化、抗炎、降糖、抗菌等作用［9］。

本研究通过对黄连生物碱的相关靶点进行筛选，共有20 个靶点蛋白，通过对预测靶点的蛋白-蛋白相互作用网络的构建及拓扑学参数分析，可知靶蛋白具有一定协同性，在GO 通路富集分析可知，预测靶点蛋白的作用于循环及神经体液因素相关。在KEGG 分析过程中，结果预测其主要与神经体液、离子信号通路等相关调节。其神经活性配体-受体作用通路包括了α2肾上腺素能受体、M2胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptor m2，CHRM2）等。在心力衰竭的神经体液机制中，随着心脏射血量不足，交感神经系统活性增高，体内的去甲肾上腺素水平升高，作用于β1肾上腺素能受体，通过cAMP-PKA通路，使细胞内cAMP升高，激活钙离子通道，使细胞内Ca2+浓度升高，从而增加心肌收缩，提高心排血量。且增加心脏后负荷，心肌耗氧量上升，同时会提高心率。同时去甲肾上腺素的水平升高，可直接导致心肌细胞凋亡、坏死，最终使心室重构，导致心脏衰竭。神经活性配体-受体相互作用通路中，其预测机制可能是激动血管壁的α2肾上腺素能受体，抑制去甲肾上腺素释放，降低细胞内Ca2+浓度，从而拮抗交感神经兴奋性增强，减少心室做功，从而达到拮抗心室重构的作用［10］。相关临床研究发现，α2肾上腺素受体激动药物可乐定可用于治疗急性或慢性心力衰竭［11］。M 胆碱受体具有胆碱能神经传递作用，其中M2 型主要分布于心脏和突触前末梢，其作用机制为通过与G 蛋白偶联，激活受体激活磷脂酶C，促进IP3 与DAG 生成，抑制腺苷酸环化酶活性，调节K+/Ca2+离子通道，从而调节心肌收缩。在心力衰竭的过程中，血浆中去甲肾上腺素水平升高，短期内可进行代偿血流动力学异常，长期保持浓度增加可导致心肌缺血，从而发生心律失常。相关临床研究发现，M2受体具有调节心率的作用［12-13］。根据蛋白互助网络可知，CHRM2与ADRA2具有协同作用，可以预测，黄连生物碱可激动M 受体，起到减慢心率，减缓心肌收缩力，减少心肌耗氧量，缓解心肌缺血，起到保护心肌细胞的作用。

钙离子通道广泛存在于机体细胞中，起到调节细胞内钙离子浓度的作用，从而起到产生、传递兴奋、介导兴奋-收缩偶联等作用。它有多种亚型，在心脏部位主要为L 型，在KEGG 结果中，它又包括了NOS2 及CHRM2 等。NOS2 可通过PKG 磷酸化抑 制Ca2+内 流，降 低β 肾 上 腺 素 受 体 表 达［14］。CHRM2可通过与G偶联，调节Ca2+离子通道，从而调节心肌收缩。心力衰竭时交感神经兴奋性增强，心脏β 肾上腺素受体激活，使心肌细胞钙离子通道开放，代偿心脏负荷变化，长期导致心脏重构，可预测其作用机制为通过调控钙离子通道，拮抗心肌过度收缩，拮抗心室重构。

心脏重构是导致心力衰竭发展的基础，心脏功能受损，心腔增大、心肌肥厚进行代偿；心肌氧耗及能量不足，更加剧了心肌整体收缩力下降，形成恶性循环。HIF-1 信号通路主要表达在缺氧的状态下发挥作用，HIF-1 由α 和β 两个亚基组成，缺氧时，脯氨酸羟化酶的羟化作用减弱，HIF-1a的降解减少，同时增强缺氧相关基因的表达。研究发现，心脏特异性pVHL 基因被敲除的小鼠，其心肌纤维化，心肌发生重构，导致其心力衰竭［15］。HOLSCHER 等［16］研究发现，心力衰竭患者心肌的HIF 表达与正常心肌相比，增长了1.5 倍。通过KEGG 及蛋白-蛋白互助网络结果，可预测机制或为通过抑制HIF-1 表达，降低HIF-1 的浓度，起到保护心肌细胞的作用。

cGMP/cAMP 为细胞内第二信使物质，是第一信使作用后产生的信息分子。其具有调控心肌、血管等功能。当β 肾上腺素受体激活后，cAMP 可激活PKA，通过作用于心肌肌钙蛋白，降低Ca2+敏感性；同时可加速横桥循环，使心肌舒张［17］。另一方面，心肌细胞钙离子通道使其作用靶点，通过增加Ca2+通道开放率，使动作电位时细胞内Ca2+浓度上升，增强心肌收缩力［18］。LV等［19］研究发现，β1-ARcAMP-PKA 通路激活使心脏成纤维细胞的增殖，长期β 肾上腺素受体激活与心脏纤维化密切相关，将诱导心肌细胞凋亡，导致心脏衰竭的发生。cGMP 通路受多种物质影响，包括一氧化氮、钠尿肽等。心力衰竭时心肌细胞为适应心脏负荷，结构发生改变，导致心肌细胞缺氧、ATP 合成减少，引起一系列病理反应，导致cGMP-PKG 信号通路中断，心肌重构的发生。根据KEGG 通路分析可知，在cGMP/cAMP 通路的作用机制或为通过神经活性配体-受体相互作用通路，通过神经体液机制，调控β 肾上腺素受体激活，影响cGMP/cAMP 的水平，调整钙离子内流及PKA、PKG 的浓度，从而抑制心肌细胞凋亡。

本研究通过网络药理学发掘黄连生物碱治疗心力衰竭的靶点，探讨了黄连生物碱治疗心力衰竭的机制，为心力衰竭的治疗发展开辟了新的思路，对未来的相关实验研究提供了新的方向。本次研究仍有不足之处，未能对网络药理学挖掘的黄连生物碱治疗心力衰竭的靶点进行实验认证。