甘肃两种道地药材当归及党参中药饮片中微生物污染状况研究*

孙 莺，王玉梅，尉 鹏，杨平荣，谢亲建，郭小雨

1 甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730000；2 国家药监局中药材及饮片质量控制研究重点实验室；3 武警甘肃省总队医院；4 西北师范大学生命科学学院

中药饮片是指依据我国传统的中医药理论，将中草药进行加工炮制可，直接应用于中医临床或制剂生产应用的处方药品［1］。它是一种特殊的药品类型，介于农产品和药品之间，它的品质直接影响药物临床使用的安全性和效果［2-4］。微生物污染是饮片外源性污染的主要形式之一，也是影响人体健康的重要途径［5］，不只对饮片本身和它加工所得的中成药产物的质量优劣和使用安全产生影响［6-8］，并且被微生物污染过的药品物理、化学性质也可能会产生变化，从而使药品有效性下降，甚至被微生物和酶降解的产品，使用后轻者会出现不良反应，重者或出现生命危险［9］。

迄今为止，《欧洲药典》（European pharmacopoeia，EP）、《美国药典》（United States pharmacopoeia，USP）、日本药局方（Japanese pharmaceutical agency，JPA）［10］都收载了植物药或天然药的微生物检查方法和微生物限度标准，如需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌的检查。在现行的2015 版《中华人民共和国药典》［11］（以下简称《中国药典》），增加了针对研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片中控制菌沙门菌和耐胆盐革兰阴性菌的限度要求，但还没有对需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的限度要求。

研究近年文献，我们可以看到我国当前较高的中药饮片的微生物负载量，而且各种中药饮片的微生物污染量差别很大，迫切需要解决卫生方面的质量安全问题［12-17］。

甘肃是全国中药材资源大省，素有“千年药乡”之称，特别是道地药材种植形成一定规模。本研究以两类甘肃道地药材当归、党参中药饮片为研究对象，考察其微生物污染状况，初步掌握微生物污染负载水平，为中药饮片微生物污染风险评估和微生物标准的制定提供数据支持，从而推动中药饮片产业的持续健康发展。

1 材料与仪器

1.1 中药饮片本研究所用甘肃省市售当归中药饮片共31 批样品，来源于甘肃、安徽、河北、陕西的26 个不同厂家。市售党参中药饮片共30 批样品，来源于河北、陕西、甘肃、安徽的23 个不同厂家。

1.2 试剂pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液（批号：20191102）；胰酪大豆胨琼脂培养基（tryptone agar medium for soybean，TSA）（批号：20190930）；胰酪大豆胨液体培养基（tryptone liquid medium for soybean，TSB）（批号：20191212）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（sabouraud dextrose agar，SDA）（批号：20190912）；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（amaranth bile salt glucose agar medium）（批 号：20190930）；肠道增菌液体培养基（Intestinal bacterial augmentation liquid medium）（批号：20191130）；RV 沙门菌增菌液体培养基（RV Liquid medium for salmonella augmentation）（批 号：20191102）；木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（Xylose lysine deoxycholate AGAR medium，XLD）（批号：20181124）；三糖铁琼脂培养基（triple sugar iron agar medium，TSI）（批号：20190930）。以上试剂均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.3 仪器SW-CJ-2D 型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；ClassⅡBSC 型生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；BPMJ-250F 型生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Veriti 型PCR仪（美国赛默飞科技公司）。

2 实验方法

参照《中国药典》2015 年版中“非无菌产品微生物限度检查微生物计数法”（通则1105）和“非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法”（通则1106）进行检查［14］。

2.1 供试品溶液的制备称取10 g样品，加入到100 mLpH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液中，振荡，制成1∶10的供试品溶液。

2.2 需氧菌总数(TAMC）计数取“2.1”项下1∶10供试液，用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍稀释至1×10-5，采用平皿法计数，1 mL/皿，平行制备2 个平皿，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，33℃培养5天。

2.3 霉菌和酵母菌总数(TYMC)的测定取“2.1”项下1∶10 供试液，用pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍梯度稀释至1×10-4，采用平皿法计数，1 mL/皿，平行制备2个平皿，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，23℃培养7天。

2.4 控制菌的检查

2.4.1 耐胆盐革兰阴性菌（bile-tolerant gramnegitive bacteria，BGB） 取“2.1”项下1∶10 供试液，按照2015 年版《中国药典》四部通则“微生物计数法”［14］进行耐胆盐革兰阴性菌的定量检查和定性检查。取1×10-1、1×10-2和1×10-3供试品稀释液1 mL 分别接种至10 mL 肠道增菌液体培养基中，35℃下培养48 h。取相当于l g样品的上述预培养物接种至100 mL 肠道菌增菌液体培养基中，33℃培养24 h 后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33℃培养24 h。

2.4.2 沙门菌 取饮片样品10 g，接种至胰酪大豆胨液体培养基100 mL 内，33℃下培养48 h。取上述培养物0.1 mL 接种至10 mLRV 沙门菌增菌液体培养基中，33℃下培养48 h。取少量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基平板上，33℃下培养48 h。

3 结果

3.1 需氧菌总数检测结果将需氧菌总数（TAMC）的结果取对数（以IgTAMC 表示）。以饮片品种为横坐标、IgTAMC 值为纵坐标作箱式图，结果见表1和图1。本次试验所选取的61个批次中药饮片均检出需氧菌，IgTAMC 的均值为3.32，最小值为2.05，最大值为6.30。61批饮片样品的IgTAMC 值均小于7.0，整体水平符合欧洲、日本药典标准。61 批样品中只有1 批当归饮片IgTAMC 值超过6.0，即98.4%的饮片符合欧洲、美国、日本药典标准。各国药典与中药饮片相当的植物药或生药的微生物限度值见表2。当归饮片的IgTAMC 值为2.60～6.30，表明其污染的TAMC 各批间差异较大，质量不稳定；党参饮片的IgTAMC 值为2.05～5.05，表明其污染的TAMC 较当归低，且各批间差异小。

表1 饮片样品TAMC和TYMC测定结果

图1 中药饮片样品中需氧菌总数计数结果

3.2 霉菌和酵母菌总数检测结果酵母菌和霉菌也是中药饮片中常见的污染菌，部分霉菌会产生有毒代谢物，危害极大。本试验中两种饮片共61 批样品均检出酵母菌和霉菌，以饮片品种为横坐标、酵母菌和霉菌总数的Ig 值为纵坐标作箱式图，见图2，由图可知，61 批次中药饮片IgTYMC 的均值为1.69，最小值为0.70，最大值为3.23，表明这2 种饮片样品的TYMC 负载相对较低。31 批当归中药饮片，IgTYMC 值为0.70～3.23，IgTYMC 最大值为3.23，IgTYMC 值总体均数为1.86；30 批党参中药饮片样品，IgTYMC最大值为2.49，IgTYMC值总体均数1.52。约60%的当归饮片样品IgTYMC介于1.50～2.00，约67%的党参样品IgTYMC 介于1.25～2.00；所有饮片中，仅当归中的1 批样品IgTYMC大于3.00，其余所有饮片样品IgTYMC均小于3.00。结果表明61 批当归和党参中药饮片均符合《美国药典》《欧洲药典》《日本药典》限度标准，不同批次样品之间差别小，质量稳定，见表2。当归饮片的霉菌和酵母菌污染程度高于党参饮片。

图2 中药饮片样品中酵母菌和霉菌总数计数结果

表2 各国药典与中药饮片相当的植物药或生药的微生物限度值

3.3 控制菌测定结果

3.3.1 耐胆盐革兰阴性菌 61 批中药饮片中，29 批检出耐胆盐革兰阴性菌，占47.5%，其中当归24 批，党参5 批，分别占各自批数的77.0%和16.7%。不同批次和来源的同种饮片耐胆盐革兰阴性菌差别很大，党参饮片耐胆盐革兰阴性菌污染程度较低，明显低于当归饮片。

3.3.2 沙门菌检测 经检验，61 批饮片中均未检出沙门菌。

4 讨论

甘肃是我国中药材种植最大省份之一，当归和党参又是甘肃的道地大宗中药材。这两种根类药材，因生长在土壤中，较长时间接触到土壤中的有害元素和各种微生物，容易受到栽种的环境、肥料的影响，也容易受到外来微生物的污染。为了加强中药饮片在临床上使用的安全有效，本研究以市售甘肃道地药材当归和党参中药饮片为实验对象，参照《中国药典》（2015 版）四部通则的非无菌产品微生物检查方法，从TAMC、TYMC、耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌这四方面对微生物污染水平进行评价。因为《中国药典》（2015 版）当前对需氧菌总数、酵母菌和霉菌总数限度标准未做出要求，本文从现行《美国药典》《欧洲药典》《日本药典》三方面进行判定。

研究结果显示，甘肃省市售的61 批当归和党参中药饮片均检出需氧菌、酵母菌和霉菌，61批饮片需氧菌总数平均值超过103CFU/g，最大值超过106CFU/g。霉菌及酵母菌总数平均值达到102CFU/g，最大值超过103CFU/g，耐胆盐革兰阴性菌检出率47.5%，全部饮片样品都没有检出含沙门菌，可见微生物负载量较高，污染程度依旧相当严重，各中药饮片样品的微生物负载量差异很大，同一市售厂家同种中药饮片不同批次之间微生物污染程度差异也很大［15-17］。

我国中药饮片品种多，生产、流通、经营各个环节都可能带入外源性污染，威胁用药安全。较中成药而言，中药饮片微生物限度要求很长时间以来一直被人们所忽视，数据资料显示我国中药饮片的载菌量偏高，已经对中药饮片本身和饮片所制得的中成药的品质和使用的安全产生了很大影响，但建立健全的微生物限度标准必定需要大量数据的支持，而我国中药产业的现状决定了这还需要很长一段时间的努力才可实现。基于本研究结果，应将微生物检测方法和标准与我国国情相结合，把握饮片质量现状，制定出合理的标准，全面评估中药饮片微生物污染的风险。进一步加大过程监控力度，强化中药饮片的生产环节，减小中药饮片临床利用的安全隐患，增强药品质量安全，推进我省中药饮片行业健康发展，为行业发展助力。