基于网络药理学高脂血症中医药治疗靶点预测

★ 张璋 张婉晴 单思（.江西中医药大学药学院 南昌 330004；.江西中医药大学中医基础理论分化发展研究中心 南昌 330004）

高脂血症是由于人体脂质代谢异常使血浆中脂质和脂蛋白水平异常，表现为血清胆固醇、甘油三酯或低密度脂蛋白的水平升高，或高密度脂蛋白水平降低［1］。该病常见于中老年人，但是随着社会发展和竞争压力增大，吸烟饮酒人群的扩大，高脂血症的发病率不断增长，患者的也越来越年轻化。高脂血症是导致动脉粥样硬化的重要致病因素，动脉粥样硬化又是导致心脑血管疾病的元凶。在青年时期高脂血症没有症状表现，但它实际不断侵蚀血管上皮细胞，逐渐增加血液黏度，形成血管硬化，引发高血压、心绞痛、心肌梗死、中风，肾性高血压、肾功能衰竭，肝损伤，侵害机体细胞，机体酸化，肥胖，降低人体抵抗力。在前期基于数据挖掘对中医药治疗高脂血症中药用药规律研究找出治疗高脂血症3个中药组合（组合1：半夏、陈皮、茯苓、白术；组合2：山楂、大黄、丹参、决明子、何首乌、泽泻；组合3：枸杞子，山茱萸，山药，熟地黄）［2］。网络药理学整合强大的生物信息学数据库和IPA软件分析，提高了研究对象的针对性和前瞻性，为后续的验证研究提供清晰思路和更多的想象空间。为探析这三个中药组合治疗高脂血症的作用机制，进一步通过网络药理学方法预测分析中药组合及高脂血症的分子作用网络和作用位点。

1 研究方法

1.1 高血脂症人类相关基因数据获取

利用Gene Cards数据库，以hyperlipidemia为关键词，查找高脂血症的人类相关基因，获取高脂血症Gene Symbol。

1.2 药物活性成分数据的获取

联合利用TCMSP数据库、TCMID、BATMANTCM数据库，检索药物组合1（茯苓、白术、陈皮、半夏）、药物组合2（泽泻、决明子、大黄、丹参、山楂、何首乌）、药物组合3（熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子）化学成分，检索词均为药物中文拼音。

TCMSP检索到的药物组合1（茯苓、白术、陈皮、半夏）、药物组合2（泽泻、决明子、大黄、丹参）、药物组合3（熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子）化学成分利用ADME参数，筛选药物活性化合物。参考数据库建议标准制定筛选标准：分子量180~500，生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18，药物半衰期（HL）≥4h且有PubChem_Cid的成分。TCMSP检索不到的山楂利用TCMID检索，何首乌利用BATMAN-TCM检索。检索到的药物组合化合物取交集绘制韦恩图。

1.3 药物靶点预测

有机小分子生物活性数据库PubChem查找各药物的分子信息，输入PubChem_Cid查找并获取靶蛋白Canonical SMILES。将相应的Canonical SMILES粘贴至Swiss Target Prediction数据库预测化合物潜在作用靶点，按Pro>0.1筛选并获取相应靶蛋白Common Name。

分别将各药物组合活性成分靶蛋白与高脂血症相关基因靶点取交集绘制韦恩图，提取交集靶标基因；并将三个药物组合同时与高脂血症相关基因靶点取交集绘制韦恩图，提取交集靶标基因。

1.4 构建药物预测靶点和高脂血症相关基因分子网络

分别将药物组合对应靶蛋白Common Name及高脂血症的相关基因Gene Symbol，以excel格式上传至IPA软件的Dataset Files。运行Core Analysis模块进行网络分析，分别构建药物组合和高脂血症相关基因的分子网络。

1.5 比较分析药物预测靶点及高脂血症相关基因共同作用的生物学通路及作用位点

利用IPA软件中的Comparison Analyses模块，比较分析药物组合预测靶点及高脂血症的人类基因的生物学通路；进一步选取部分共同作用的通路进行深入研究，筛选出二者在共同作用的生物学通路中的作用位点。结合通路结果和位点筛选结果，分析预测药物组合治疗高脂血症可能的分子网络机制。

2 结果

2.1 高血脂症靶点数据

截止至2020年5月，GeneCards数据库检索到高脂血症的人类相关基因，即疾病靶点154个。

2.2 药物活性成分筛选

截止2020年5月，利用TCMSP数据库对药物组合1（茯苓、白术、陈皮、半夏）、药物组合2（泽泻、决明子、大黄、丹参）、药物组合3（熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子）化学成分，以相对分子质量180~500，生物利用度≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18，药物半衰期≥4 h，且有PubChem_Cid的成分为标准。剔除重复值后，药物组合1（茯苓、白术、陈皮、半夏）、药物组合2（泽泻、决明子、大黄、丹参）、药物组合3（熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子）筛选最终获得有效活性成分23、50、29个。利用TCMID数据库检索到山楂活性成分94个。利用BATMAN-TCM检索到何首乌活性成分25个。通过将检索到的药物组合的化学成分提取交集绘制韦恩图可发现，各药物组合之间既有独有成分亦有部分相同活性成分，见图1。推测各药物组和可能通过相同的生物通路或者作用靶点发挥作用。

图1 各药物组合活性成分韦恩图

2.3 靶蛋白数据的获取筛选及高脂血症疾病靶点提取结果

根据PubChem数据库和Swiss Target Prediction数据库，获取各药物组合有效活性成分，以Excel格式上传IPA数据库，数据库比对后，匹配药物组合1、药物组合2、药物组合3靶蛋白分别387、181、388个（Pro>0.1）。通过检索GeneCards数据库得到的高脂血症疾病相关靶标共154个，与药物组合1、药物组合2、药物组合3活性成分预测靶标相映射，分别得到交集靶标20、9、15个。见表1、图2。即为药物组合1、药物组合2、药物组合3活性成分作用于高脂血症的潜在靶点。

图2 药物组合预测靶点与高血脂靶点症韦恩图

表1 药物组合作用于高脂血症潜在交集靶标

2.4 构建药物组合和高脂血症分子网络

分别将药物组合靶蛋白及高脂血症相关基因导入IPA进行Core Analysis分析，结果显示，构建的各个分子网络错综复杂，功能多样，但亦有共同的交联分子及功能。见表2、图3。图中每个节点代表一个分子，其中灰色的节点为网络相关基因，中心区域着色的为药物组合与高血脂症交联的分子，中心区域红线内着色分子（PPARA、PPARD、SQLE）为3组药物组合共有交联分子，SLC10A2为药物组合1独有。未涂色的为构建网络所需的相关分子。实线表示分子间直接作用关系，虚线表示分子间接作用关系。

表2 药物组合靶蛋白与高脂血症分子网络

图3 药物组合作用于高血脂症相关基因分子网络图

2.5 药物与高脂血症生物学通路比较与作用位点分析

通过IPA软件的Comparison Analysis分析，比较分析药物组合靶蛋白和高血脂症相关基因作用的生物学通路，结果发现四者共同作用通路有296条，以炎症、免疫以及细胞增殖、凋亡和迁移相关通路为主。见图4。提示药物组合活性成分可能通过干预炎症、免疫以及代谢相关通路治疗高脂血症。

图4 药物组合与高脂血症共同作用的生物通路

药物组合活性成分靶蛋白和高脂血症相关基因共同交联靶分子有ABCB1（三磷酸腺苷黏合转运体B1）、AKT1（AKT丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1）、ALOX5（花生四烯酸5-脂氧合酶）、APP（淀粉样β前体蛋白）、CXCR1（趋化因子受体1）、EGFR（表皮生长因子受体）、AR（雄激素受体）、ESR1（雌激素受体1）、F2（凝血因子II）及IL2（白介素2）等27个。基于以上分析结果选取了一条LXR/RXR信号通路，在通路中边框涂色标记的MMP9（基质金属蛋白酶9）、HMGCR(3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)、NOS(一氧化氮合酶)等多个位点为药物组合活性成分靶蛋白参与高脂血症相关通路的作用位点。见图5。图中每个节点代表一个分子，其中灰色的节点为网络相关基因，未涂色的为构建通路所需的相关分子。实线表分子间直接作用关系，虚线表分子间接作用关系。红色圈分子为药物组合1、2、3共同作用位点、绿色圈分子为药物组合1独有作用位点，蓝色圈分子为药物组合3独有作用位点

图5 药物活性成分靶蛋白和高血脂症相关基因共同作用LXRRXR信号通路作用位点

3 讨论

中医学中并无高脂血症病名，属中医学“脂浊”“痰”“痰浊”“痰瘀”“血瘀”“眩晕”“胸痹”“真心痛”及“消瘅”等范畴。中医学对高脂血症病因病机认识有先天禀赋、饮食不节、过逸少劳、情志因素、痰浊不化、瘀血阻滞、脏腑失调等不同，通过化痰祛浊、活血祛瘀、健脾祛湿、疏肝理气、温阳补肾等治法，达到扶正祛邪、标本兼治、调整阴阳。

前期研究中药物组合1有茯苓、白术、陈皮、半夏等中药，从结构上看类似二陈汤组成，化痰药为基础。药物组合2有泽泻、决明子、大黄、丹参、山楂、何首乌等中药，活血化瘀药为基础。药物组合3有熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子等中药，补益肝肾药为基础。3个组合在中医治疗中可针对不同证候类型辨证施治，在治疗高脂血症过程中是否具有共同的机制尚未知。

联合Gene、PubChem数据库和IPA软件分析技术能够预测药物和疾病的分子机制和作用靶点，为生物学网路和通路研究提供新思路［3］，3个组合和高脂血症构建的分子网络较复杂，表达多样性的生物功能，3个药物组合与高血脂症共有的交联分子PPARA、PPARD、SQLE。分析结果提示：药物组合活性成分可能通过干预LXR/RXR信号通路等炎症、免疫以及代谢相关通路治疗高脂血症。通过信号通路中的MMP9、HMGCR、NOS等位点来干预HLP。MMP9表达在高脂血症临床病理因素中发挥重要的作用，表达水平可能代表疾病严重程度的一个指标［4-9］。通过药物降低MMP9，可以调节血脂，稳定斑块，降低IMT值，抗AS，对原发性高脂血症合并其他疾病有较好疗效［10-11］。HMGCR活性大小影响胆固醇合成速度，是胆固醇合成关键酶。不仅山楂、决明子、泽泻等中药复方提取物能下调HMGCR表达降低高脂血症模型大鼠血脂水平［12］，因为下调HMGCR表达能够抑制胆固醇生物合成，进而调节脂质代谢紊乱［13-15］，阿托伐他汀酯也是通过调节PPAR信号通路和HMGCR基因表达来调节血脂水平［16］。有关文献提示NOS的活力提升有助于提高血管内皮细胞分泌NO的能力，改善血管内皮功能，改善细胞形态；促进细胞增殖；抑制细胞凋亡，抑制炎症反应，损伤的血管内皮细胞有保护作用，可调节血脂代谢［17-20］。如山楂浓缩汁极显著提高了肝脏中NO含量和NOS活性，对高脂血症小鼠有一定的降血脂作用［21］。3个药物组合可针对不同中医辨证分型病人施于治疗，MMP9、HMGCR、NOS可能是以上3个药物组合共同对HLP的作用靶点，可以提示我们治疗HLP的基础靶点应该包括此类靶点，进一步提示药物组合活性成分可能通过干预炎症、免疫以及代谢相关通路治疗HLP。