槟榔芋萌发早期的营养物质及激素水平变化研究

2022-05-20李莉莉商飞飞谢玉花陈云堂段振华

核农学报 2022年6期

李莉莉商飞飞谢玉花陈云堂崔龙段振华

(1 大连工业大学食品学院，辽宁大连 116034；2 贺州学院食品与生物工程学院，广西贺州 542899；3河南省科学院同位素研究所有限责任公司/河南省核农学重点实验室，河南郑州 450015)

槟榔芋又称香芋，是天南星科茎块类多年生水生作物，可做主食，其品种多样，主要生长于热带与亚热带地区[1-2]。槟榔芋的营养价值极高，其蛋白质、脂肪、碳水化合物与膳食纤维含量分别是马铃薯的1.7、5.7、1.7及1.25倍[3]。发芽是导致槟榔芋采后损失的一个重要原因。每年11月采收至翌年清明前后为槟榔芋的贮藏期，此期间内槟榔芋含水量较高，在一定条件下极易发芽，不利于贮藏[4]，加之冷库湿度较大，能促进槟榔芋芽点部位细胞的生长，促进快速发芽。而发芽会带来自身营养消耗、水分散失等问题。

种子萌发过程十分复杂，由几条不同的途径共同作用[5-6]。以脱落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(gibberellin，GA3)为主的植物激素在调节种子休眠和萌发方面发挥着重要作用[7]。GA3在萌发的早期和后期均可抵消ABA的抑制作用，维系种子的萌发与生长[8-9]。生长素调节着植物的生长和发育，诱导种子萌发[10-12]。目前国内外关于植物萌发早期的报道主要集中在马铃薯[13]、黑豆[14]、绿豆[15-16]等植物上，如薛莉媛[13]对马铃薯块茎发芽的有关特性进行研究，发现发芽会使马铃薯芽端淀粉含量下降；Julián 等[14]研究了去皮、发芽和挤压对黑豆理化特性的影响，结果表明发芽会导致黑豆淀粉及蛋白质含量下降。但针对槟榔芋发芽后机体内部生理变化规律的研究甚少。本试验对3种不同发芽程度槟榔芋的芽点部位淀粉、蛋白质、水分迁移动态及发芽后不同部位(芽、块茎、根须)的激素水平进行测定分析，探究萌发早期槟榔芋营养物质及激素水平的变化规律，以期初步了解槟榔芋休眠及萌发机理，为探究槟榔芋休眠及贮藏后的萌发规律提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槟榔芋，采购于贺州市八步区知富农业开发有限责任公司冷库，选取大小均匀，单个球茎重量在600～700 g之间的槟榔芋；总蛋白(total protein, TP)测定试剂盒(考马斯亮蓝法)、植物淀粉含量测试盒，南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Kromasil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，瑞典阿克苏诺贝尔公司；Rigol L3000高效液相色谱仪，北京普源精仪科技有限责任公司；NB90水分测定仪，常州奥豪仪器有限公司；NMI20核磁共振仪，苏州纽迈电子科技有限公司；H1650-W微量台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；EVO300 PC紫外可见光分光光度计、可调节式移液枪，美国Thermo Fisher公司；FJ 2000均质机，上海标本仪器有限公司；HH-S2数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；YP1201N电子天平，上海天平仪器总厂。

1.3 试验方法

1.3.1 槟榔芋发芽处理将槟榔芋于25℃条件下自然发芽，发芽芋头按芽的长度可分为短芽(1～4 cm)、中芽(5～8 cm)和长芽(9～12 cm)，如图1-A所示。

图1 3种发芽长度槟榔芋(A)和距球茎顶端1～5 cm部位(B)Fig.1 Areca taro three germinating lengths (A) and 1～5 cm from the top of the corm (B)

1.3.2 淀粉含量的测定球茎顶端以下以1 cm厚度为单位断层取样，由于距离超过3 cm后的部位淀粉含量无明显变化，因此本试验选取距球茎顶端1～3 cm部位进行淀粉含量测定，3个芋头为一组混合取样，获取均匀样品。采用植物淀粉含量测试盒进行淀粉含量测定。

1.3.3 蛋白质含量的测定选取距球茎顶端1～5 cm部位进行总蛋白质含量测定，其他处理与淀粉含量测定一致。采用总蛋白(TP)测定试剂盒(考马斯亮蓝法)进行蛋白质含量测定。

1.3.4 水分含量的测定采用快速水分测定仪对不同发芽程度槟榔芋块茎顶部的1～5 cm断层部位进行水分含量测定，每次3个重复。

1.3.5 低场核磁(low field nuclear magnetic resonance, LF-NMR)及磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI) 槟榔芋球茎顶部1～5 cm部位，每1 cm厚度为1片，共切5片，如图1-B。在每片芋头的中间分别取长1.5 cm×宽0.8 cm×高0.8 cm的长方体为样品，待测定。试验采用低场核磁共振分析仪，同时利用分析软件FID脉冲序列校正初始系统参数，参数测定参考梅成铭等[17]的方法。

多脉冲回波序列CPMG参数：主频(spectrometer frequency, SF)18 MHz，偏移频率(frequency offset 1, O1)430 400.17 Hz，90°脉冲时间(90° pulse length, P1)8.52 μs，180°脉冲时间(180°pulse length, P2)17.04 μs，累加采样次数(the summation of number, NS)为4，回波个数(the number of echoes, NECH)为 8 000，采样点数(time data, TD)为160 004，采样频率(spectral width, SW)为100 kHz，采样等待时间(time wait, TW)为3 500 ms，开始采样时间(regulate first data, RFD)为0.25 ms。

MRI参数：主频SF01为18.42 MHz，重复采样等待时间(repetition time, TR)为500 ms，回波时间(echo time, TE)为20 ms。

1.3.6 激素水平测试

1.3.6.1 样品取样由于发芽后芋头球茎顶端1～2 cm处的块茎部位生长最迅速，此部分激素含量更能表现槟榔芋萌发早期过程中块茎部位的激素水平变化，因此选取不同发芽长度槟榔芋球茎顶端1～2 cm处的块茎、萌发的芽和根须3个部位的组织，分别测定脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)水平。

1.3.6.2 样品预处理称取约0.1 g样本，放入研钵中磨碎，加入1 mL预冷的5%磺基水杨酸溶液，4℃浸取过夜；8 000 r·min-1离心10 min，残渣用0.5 mL 5%磺基水杨酸溶液浸取2 h，离心后取上清液，合并两次上清液，40℃氮气吹干至不含有机相；加入0.5 mL 25 mmol·L-1HgCl2水溶液萃取脱色3次，弃去上层醚相，下层水相用5%NaClO-NaOH调节pH值至2.8，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相氮气吹干；用甲醇定容至0.5 mL，取适量溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内待测。

1.3.6.3 脱落酸(ABA)液相色谱(liquid chromatogram, LC)分析条件分析平台：Rigol L3000高效液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇∶1%乙酸水=50∶50；进样量：10 μL，流速：0.8 mL·min-1；柱温：35℃；运行时间：30 min；紫外检测波长：254 nm。

1.3.6.4 赤霉素(GA3)LC 分析条件分析平台：Rigol L3000高效液相色谱仪；色谱柱：Kromasil C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇∶1%乙酸水=35∶65；进样量：10 μL，流速：1.0 mL·min-1；柱温：30℃；运行时间：30 min；紫外检测波长：254 nm。

1.4 数据处理

数据采用Excel 2010软件进行统计分析，采用Origin 2019软件绘图，试验结果以平均值±标准误差表示，采用SPSS 24.0软件进行显著性差异分析，P<0.05表示显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同发芽程度槟榔芋不同球茎部位淀粉含量变化

发芽槟榔芋球茎的不同部位淀粉含量变化如图2所示。3种发芽程度槟榔芋越接近球茎中心淀粉含量越高；长芽生长消耗淀粉较多，因此长芽的发芽点部位(球茎顶部)以下1～2 cm的淀粉含量显著低于中芽(P<0.05)；短芽球茎顶端以下1 cm部位淀粉含量略高于长芽，显著低于中芽(P<0.05)，但在2 cm部位和中芽相近；在球茎顶端以下3 cm处不同发芽程度的槟榔芋淀粉含量相近。由此可见，贮藏期槟榔芋发芽程度与发芽点部位周围淀粉含量密切相关，长芽生长所消耗的淀粉含量最高。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.图2 发芽槟榔芋球茎不同部位的淀粉含量变化Fig.2 Changes of starch content in different positions of corm of germinated Areca taro

2.2 不同发芽程度槟榔芋不同球茎部位蛋白质含量变化

槟榔芋萌发早期的蛋白质含量变化如图3所示。从各芽点部位蛋白质含量随其与球茎顶端的距离变化来看，未发芽、短芽及中芽组呈现下降趋势，而长芽芋头组呈先上升后下降再上升的波动变化。在距球茎顶端1 cm处，未发芽芋头组蛋白质含量最高，为0.76 g·L-1，而长芽芋头组蛋白质含量最低，为0.18 g·L-1。与之相反，在距球茎顶端5 cm处，长芽芋头组蛋白质含量最高，为0.51 g·L-1，而未发芽芋头组蛋白质含量最低，为0.12 g·L-1。由此可见，发芽可降低槟榔芋球茎顶部1 cm处的蛋白质含量，提高5 cm处的蛋白质含量。

注：每种发芽程度所示的不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Note: The different lowercase letters for each degree of germination indicate significant differences at 0.05 level. The same as following.图3 发芽槟榔芋球茎不同位置的蛋白质含量变化Fig.3 Changes of protein content in different positions of corm of germinated Areca taro

2.3 槟榔芋萌发早期水分迁移动态分析

2.3.1 不同发芽程度槟榔芋不同球茎部位水分含量变化由图4可知，不同发芽程度槟榔芋的不同芽点部位水分含量随其与球茎顶端距离的增加整体呈现先下降后上升的趋势。整体上，距球茎顶端2 cm处的水分含量与1 cm处相比显著降低，距球茎顶端4 cm处的水分含量与5 cm处无显著差异。从图1-B可以看出，距球茎顶端2 cm处是根须生长最为旺盛的部位，因此此处水分含量的下降可能与根须生长有关。

图4 发芽槟榔芋球茎不同部位的水分含量变化Fig.4 Changes of water content in different positions of corm of germinated Areca taro

2.3.2 不同发芽程度槟榔芋不同球茎部位水分迁移动态分析横向弛豫时间T2的范围分别为结合水横向驰豫时间T21(0.1～1 ms)、半结合水横向弛豫时间T22(1～10 ms)和自由水横向弛豫时间T23(>10 ms)[18]。在槟榔芋萌发早期发芽部位 LF-NMR测定结果(图5)中，槟榔芋萌发早期发芽部位主要有3种水分组成，即结合水(T21)、半结合水(T22)及自由水(T23)，而图中在距球茎顶端3～5 cm处的T22与T23之间出现第4个波峰，此处定义为与淀粉相结合的自由水T23＇[19-20]。表1中随着发芽程度增加，距球茎顶端 3 cm 处的与淀粉相结合的自由水峰，即T23＇峰面积逐渐下降，由短芽芋头的583.93降至中芽芋头的445.10，至长芽芋头处完全消失，表明发芽对淀粉含量的消耗逐渐后移。此外，槟榔芋萌发早期水分迁移是动态变化的，这是由于蛋白质和淀粉等大分子物质参与水解[21-22]，整体上横向驰豫时间逐渐右移，图5中T23峰结束的横向驰豫时间由1 cm 处的351.12 ms到 5 cm 处已右移至613.59 ms，说明越靠近芋头中心部位水分活跃度越高。图中与球茎顶端距离2 cm处的T23波峰与1 cm处相比呈下降趋势，与图4所测的水分含量相对应。由表1可知，整体上结合水T21峰面积随着芋头早期萌芽长度的增加而减少，半结合水T22峰面积的变化与之相反，表明随着槟榔芋萌芽长度的增加，结合水会逐渐向半结合水转变。

图5 短芽(A)、中芽(B)及长芽(C)槟榔芋的T2驰豫图谱Fig.5 Spectra of T2 relaxation of short bud (A), medium bud (B) and long bud (C) Areca taro

2.3.3 不同发芽程度槟榔芋的不同球茎部位核磁共振成像结果食品各水分的分布及变化情况可以通过无损的核磁共振成像技术进行检测[23-24]。图6为3种不同发芽程度槟榔芋发芽部位核磁共振成像图，图片经调色后，能够更直观看出槟榔芋发芽部位的水分分布。根据 T2加权成像原则，含水率高的部分信号区域显亮，含水率低的部分信号区域显暗[25]，经过调色后，图中含水率越高的部分红色信号越明显，黄色信号表示含水率较低，绿色信号地方含水率最低。

表1 T2驰豫图谱峰面积表Table 1 Peark area of spectra of T2 relaxation

如图6所示，槟榔芋组织中的粗纤维主要为黄色区域，表明样品组织中粗纤维含水率较低。图中样品边缘的红色区域较大，表明边缘含水率较高，主要原因是对样品切分导致水分向边缘富集。整体而言，图中3种不同发芽程度槟榔芋距球茎顶端2 cm处均表现为红色区域面积较小，表明在整个芋头发芽部位处距球茎顶端2 cm处含水率最低，与图4及图5的结果一致。短芽中所观察到的红色区域最多(图6-A)，而长芽观察到的红色区域最少(图6-C)，说明3种发芽长度槟榔芋中短芽芋头的含水率最高。

图6 短芽(A)、中芽(B)及长芽(C)槟榔芋的核磁成像图Fig.6 Magnetic resonance images of short bud (A), medium bud (B) and long bud (C) Areca taro

2.4 不同发芽程度槟榔芋不同部位的激素含量变化

不同发芽程度槟榔芋距球茎顶端1～2 cm处的块茎、芽及根须的内源ABA及GA3含量变化如图7所示。结果表明，不同发芽程度槟榔芋不同部位的ABA及GA3含量有所不同，ABA含量与GA3含量的动态平衡可促进贮藏期槟榔芋早期萌发。大量研究证实，ABA可诱导种子休眠并延迟萌发[26-27]。由图7-A可知，短芽及中芽芋头组2个部位的ABA激素均为芽部位含量最低，分别为0.65、0.76 μg·g-1，均与根须部位呈显著性差异，而与块茎部位差异不显著。短芽及中芽芋头组3个部位的ABA含量变化规律基本一致。长芽组3个部位的ABA含量呈现轻微波动，均无显著差异。GA3能解除休眠，促进萌发[28]。由图7-B可知，短芽芋头组3个部位的GA3含量无显著差异，表明短芽芋头组3个部位的生长趋势一致。中芽芋头组根须部位的GA3含量最低，为1.10 μg·g-1，芽部位GA3含量最高，为2.61 μg·g-1，两者呈现显著性差异(P<0.05)，表明中芽芋头组芽部位为生长优势部位。长芽芋头组顶端块茎部位GA3含量最低，为1.34 μg·g-1，芽部位GA3含量最高，为2.53 μg·g-1，两者呈现显著性差异(P<0.05)，表明长芽芋头组芽部位为生长优势部位。

图7 发芽槟榔芋不同部位的ABA、GA3含量变化Fig.7 Changes of ABA and GA3 content in different positions of germinated Areca taro

3 讨论

本研究分析3种不同发芽程度槟榔芋的淀粉、蛋白质、水分含量及迁移状态与激素水平变化等指标，发现槟榔芋球茎顶端淀粉及蛋白质含量随发芽程度的增加而减少，表明槟榔芋早期萌发会降解接近球茎顶部的营养物质，且对淀粉及蛋白质的降解按顶端至中心的方向进行。Jia等[29]研究发现发芽会使马铃薯的淀粉及蛋白质含量损失。Elbaloula等[30]研究表明随着高粱种子发芽时间的延长，高粱面粉的淀粉、蛋白质浓度下降，其原因是淀粉和蛋白质在萌发过程中分别被降解为可溶性糖和氨基酸。因此，槟榔芋发芽过程中的淀粉及蛋白质可能被降解为低分子量的可溶性糖及氨基酸，为芽的生长提供能量。

槟榔芋萌芽早期的水分含量及水分状态是不断变化的，可以从外部环境中吸水，且在萌发时存在着复杂的化学反应，3种不同发芽程度槟榔芋距球茎顶端2 cm处的水分含量与1 cm处相比均显著降低，通过LF-NMR检验及核磁共振成像均显示出相同的结果。通过LF-NMR检验发现槟榔芋发芽芽点部位主要存在3种水分：自由水、半结合水、结合水，距球茎顶端3～5 cm处存在第4种水分，即与淀粉相结合的自由水，这部分水随发芽程度增加而后移，与发芽过程中的淀粉降解密切相关[31]；横向弛豫时间T2反映了样品内部氢质子的自由度及其所受耦合力的大小[32]。横向弛豫时间T2越长，与样品内部其他成分相互作用力越弱[33]。随着槟榔芋发芽长度增加，结合水峰面积减少，半结合水峰面积增加，结合水向半结合水转变。通过核磁共振成像结果发现，短芽芋头组红色信号最强，长芽芋头组红色信号最弱，表明短芽芋头组含水率最高，长芽芋头组含水率最低，说明槟榔芋萌芽会使不同芽点部位的含水率下降。水分是种子萌发的首要条件，自由水的存在是种子生命活跃度提升的必要条件[34]。刘素军[35]研究表明，土壤相对含水量为55%和40%时，马铃薯发芽较70%土壤相对含水率晚一周左右。以上结果表明，槟榔芋萌发需要消耗水分，因此在实际种植中需要保持较高的环境湿度。

ABA含量与GA3含量的动态平衡可促进槟榔芋早期萌发。在植物激素水平上，随着ABA积累，种子发育过程中种子的休眠开始建立和维持，而休眠期种子控制GA3生物合成的基因是否下调目前尚不清楚[36]。在根发育过程中，植物通过生长素和脱落酸的平衡来控制根的发育，生长素诱导根的生长和延伸，而ABA则在一定程度上抑制根系发育[37]。Eren等[38]采用茄子种子进行内源激素分析表明，萌发率高的种子ABA含量降低。短芽与长芽槟榔芋根须部位的GA3含量显著高于ABA含量，可诱导根须的生长及延伸。3种发芽长度槟榔芋的芽部位ABA含量表现为根须部位含量最高，芽部位最低，而GA3含量变化与之相反，表现为芽部位含量最高，块茎部位较低，根须部位最低，呈现芽部位的生长优势，利于芽的延伸。除ABA和GA3外，种子的休眠和萌发还受生长素(auxin, IAA)、乙烯(ethylene, ETH)、细胞分裂素(cytokinin, CTK)等激素影响[39]。因此，需要进一步研究各种激素调控槟榔芋早期萌发的分子机制，以期更好地了解槟榔芋萌发机理。