生物质炭对连作参地土壤肥力及微生物特性的影响
2022-05-20文子伟刘宇航潘根兴杨利民
杨 莉 勾 颖 文子伟 刘宇航 潘根兴 杨利民,*
(1 吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室培育基地,吉林 长春 130118;2 南京农业大学农业资源与生态环境研究所,江苏 南京 210014)
人参主产于我国东北林区,是我国根类药材中最具代表性的忌连作植物,其忌连作年限长达10~30年[1]。目前人参严重的忌连作现象与道地产区宜参土地资源的不断减少已成为影响人参产业发展、保障市场供给的重要阻碍。针对以上问题的解决办法已在业界达成共识,即提升老参地再利用率[1]。栽培过人参的土地称为老参地,与未栽种过人参的土壤相比,老参地土壤的比重、容重更大,总孔隙度更小,随着栽参年限的延长,土壤会出现板结,通气、透水性能下降,养分含量降低,微生物群落失调等问题[2-3]。连作人参则会出现根系活力、抗病能力降低,烧须、烂根、土传病害高发等症状,进而大面积减产甚至绝收[4]。为缩短老参地忌连作年限,学者们开展了广泛的尝试,如施用生物有机肥、生物菌剂、土壤灭菌等[5-6],结果发现老参地问题与人参-根际土壤微生态系统内诸多因素密切相关,单一的方法或技术并不能解决所有问题[7-8],参地土壤的修复、改良还需要不断探索新方法、耦合新技术,并且新技术的突破重点应在于平衡老参地土壤养分供给及改善微生物群落结构等方面[4, 9]。
生物质炭是一种新型土壤改良剂。目前已积累了较多应用生物质炭改良大田作物土壤的成功经验,研究认为这与生物质炭具有良好的土壤环境修复与调节作用有关[10-12],如降低土壤酸度与有害物质活度、提高土壤团聚性、增加田间持水量、减少养分淋失等[13]。生物质炭疏松多孔的结构还可为根际有益微生物提供良好的生存环境,有利于恢复并重建健康根际生态系统[14],从而实现农业生产的良性循环。综合上述分析,生物质炭的优势与老参地土壤修复需求高度吻合,但目前有关应用生物质炭改良、修复老参地土壤的相关研究鲜有报道。因此,本试验研究3种原料的生物质炭(玉米秸秆炭、稻壳炭和椰壳炭)对老参地土壤肥力及微生物群落的影响,探讨生物质炭对老参地土壤的修复效果,旨在为生物质炭在人参栽培土壤中的开发应用,以及逐步构建老参地土壤原位修复、养护技术提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验设计
老参地土壤改良试验地设置在吉林省白山市湾沟镇平川村(海拔719 m;126°23′~127°11′E,41°48′~42°13′N), 土壤前茬植物为人参(三年生)。起参后翻耕2~3次,深度30~40 cm,每次间隔7~10 d,翻耕过程中将遗漏的参根、杂草等清除,最后一次翻耕时施入枯草芽孢杆菌(100亿CFU·g-1,美国拜沃股份有限公司),施入量100 g·667m-2。试验地土壤基本性质如下:有机质含量38.45 g·kg-1、碱解氮83.24 mg·kg-1、有效磷34.79 mg·kg-1、速效钾160.03 mg·kg-1、pH值5.06、土壤电导率(soil electric conductivity, EC)48.35 μs·cm-1。
试验于2017—2019年在平川村老参地进行,共设置5个处理,分别为老参地(CK)、老参地+玉米秸秆炭(YMT)、老参地+稻壳炭(DKT)、老参地+椰子壳炭(YKT)和新林土处理(来源于参地周围未开发种植过的林区)。具体施入方法:将3种生物质炭(购自南京三聚生物质新材料科技有限公司,基本性质见表1)按15 kg·10m-2施用量施入土壤中,小区面积为10 m2,每处理3次重复,深翻混匀后以不添加生物质炭的老参地为对照(CK)。自然放置一个冬季,于翌年5月起垄,播种人参种子,主要的田间管理为每年进行3~5次松土,清除杂草,培土扶苗。于2019年9月取出部分人参及土壤样品,测定两年生人参根长、根重、皂苷含量及土壤理化性质等指标。
表1 3种生物质炭的基本性质Table 1 Basic properties of 3 kinds of biochar
1.2 测定项目与方法
1.2.1 人参皂苷含量测定 人参样品取回后用流水洗净,滤纸吸干水分后采用游标卡尺量取根长。然后将样品放于烘箱中低温烘干至恒重,精密称定人参样品根干重后粉碎过筛并保存。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定11种人参单体皂苷含量。总皂苷含量为各单体皂苷含量之和,具体测定方法参考文献[15]。
1.2.2 土壤理化性质 土壤pH值采用雷磁pHS-3c型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)测定,土水比为1∶5(v/w);土壤有机碳含量采用重铬酸钾法测定;速效钾含量采用乙酸铵浸提原子吸收法测定;碱解氮含量采用培养皿扩散法测定;有效磷含量采用盐酸硫酸浸提法测定。具体步骤参见《土壤农化分析》[16]。
1.2.3 土壤微生物功能多样性 采用Biolog-Eco微平板法,每孔的平均颜色变化率(average well color development,AWCD)=∑(Ci-Ri)/n。其中,Ci为ECO板每个孔对应的吸光度值,Ri为对照,n=31(培养的孔数)。
1.2.4 土壤微生物结构多样性 采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒(美国,Omega)提取细菌总DNA, Qubit3.0 DNA检测试剂盒(马来西亚,Thermofisher)精确定量DNA浓度,琼脂糖凝胶检测DNA完整性。
PCR扩增及DNA纯化回收:引物为融合了MiSeq测序平台的V3-V4通用引物[341F引物:C C C T A C A C G A C G C T C T T C C G A T C TG (barcode) C C T A C G G G N G G C W G C AG;805R引物:G A C T G G A G T T C C T T G G C A C C C G A G A A T T C C A G A C T A C H V G G G T A T C T A A T CC]。扩增条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,45℃退火20 s,65℃延伸30 s,5个循环;94℃延伸20 s,55℃退火20 s,72℃延伸30 s,20个循环。PCR扩增结束后,将纯化质检合格的扩增产物1∶1(w/w)等量混合,利用MiSeq台式测序仪(美国Illumina公司)进行双端测序。
16SrRNA V3-V4区高通量测序:由上海生工生物工程技术服务有限公司完成,对于MiSeq双端测序数据,首先根据PE reads之间overlap的关系,利用PEAR软件将成对reads拼接成一条序列,采用cutadapt软件去除原始序列3′端测序接头后根据barcode区分样本序列,并利用Prinseq软件对各样本序列进行质控和过滤,得到各样本数据。
1.3 数据统计与分析
采用Microsoft Office 2016、SPSS 22.0软件对相关数据进行统计分析,Duncan 多重比较法进行差异显著性分析,P<0.05表示具有显著差异。
2 结果与分析
2.1 生物质炭对连作人参产量与质量的影响
由表2可知,生物质炭处理后两年生人参根重、根长显著高于老参地处理,分别平均增加了384.91%和65.56%,对根重、根长促进效果最佳的处理分别为玉米秸秆炭、椰壳炭。人参皂苷PPD(protopanaxadiol)、PPT(protopanaxatriol)分别为11种单体皂苷中二醇型与三醇型皂苷之和,3种单体皂苷Rg1、Re、Rb1为《中国药典》[17]规定指标,在皂苷类物质中占比较高。分析生物质炭处理后人参样品皂苷含量差异可见,其人参总皂苷、PPD和PPT含量均高于老参地处理,平均上升了0.09、0.08、0.03个百分点。单体皂苷中除Rg1外,Re、Rb1含量表现为部分生物质炭处理低于老参地。综上,生物质炭有利于重茬参苗产量与品质的提升,对产量的促进作用大于品质。
表2 连作人参种苗质量分析Table 2 Quality analysis of ginseng seedlings
2.2 生物质炭对连作参地土壤肥力的影响
由表3可知,增施生物质炭后,土壤碱解氮、速效钾、pH值、阳离子交换量(cation exchange capacity, CEC)存在一定波动,但土壤有效磷和有机碳含量均表现出增加趋势,增幅分别为47.04%~237.73%、8.09%~38.71%,表明添加生物质炭有助于提升老参地土壤有效磷、有机碳含量。对比3种炭材料的改善效果发现,玉米秸秆炭、稻壳炭、椰壳炭处理下分别有4、5、3项土壤肥力指标高于老参地处理,平均增幅分别为17.29%、47.66%、97.07%。总体看来,施用稻壳炭对老参地土壤的改良作用优于其他2种生物质炭材料。
2.3 连作老参地土壤微生物代谢活性及碳源利用特征分析
采用Biolog-Eco平板法分析各处理下土壤微生物代谢活性,结果如图1所示。各样品AWCD值变化均呈“S”型,24 h内颜色变化不明显,24~48 h后进入对数生长期,168 h后生长趋势减缓。4个处理中,老参地AWCD值始终低于各生物质炭处理,以玉米秸秆炭、稻壳炭处理AWCD值最高,表明生物质炭处理后土壤微生物对底物碳源的利用能力增强。总体看来,144~168 h时微生物生长进入稳定期,且各处理间存在一定差异,因此选用168 h处AWCD值进行分析。
表3 生物质炭处理对老参地土壤肥力的影响Table 3 Effect of biochar treatment on physical and chemical properties of replanted soil of ginseng
图1 各处理下土壤微生物群落AWCD值变化Fig.1 Variation in AWCD of soil microbial community in different treatments
Biolog-Eco平板上含31种碳源,可分为6类。不同处理下土壤微生物对该6类碳源的利用情况如图2所示。老参地土壤微生物偏好碳源排序为聚合物类、羧酸类、氨基酸类、碳水化合物类,经生物质炭处理后土壤微生物表现为对聚合物类、酚酸类、氨基酸类、羧酸类碳源利用效率较高,其中稻壳炭处理下上述4类碳源利用率分别增加了336.99%、499.64%、330.41%、208.27%;玉米秸秆炭、椰壳炭处理下分别增加了287.30%、676.39%、295.76%、229.22%,60.39%、136.02%、125.42%、57.36%。稻壳炭与玉米秸秆炭处理后大部分碳源利用率与老参地差异显著,表明生物质炭处理后土壤微生物碳源利用能力增强且偏好碳源有所改变,以酚酸类物质为底物的功能微生物种群数量得到了提升。
图2 不同处理下土壤微生物碳源利用特征Fig.2 Characteristics of soil microbial carbon source utilization under different treatments
2.4 连作参地土壤微生物碳代谢的主成分分析
基于土壤微生物对31种碳源利用程度的差异,对不同土壤处理进行主成分分析,结果发现不同生物质炭处理后老参地土壤微生物群落功能差异明显(图3),PC1和PC2累计贡献率为86.61%,可解释大部分变异,椰壳炭与老参地分别落在第二、第三象限,二者因子得分距离较小,表明二者碳源的利用情况相似度较高,玉米秸秆炭和稻壳炭分别落在第一、第四象限,与老参地差异较大。3种生物质炭中,椰壳炭处理受PC1上主要碳源影响较大,稻壳炭受PC2上碳源影响较大,玉米秸秆炭同时受PC1和PC2上碳源影响。
图3 生物质炭处理下土壤微生物碳代谢主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon source metabolism pattern under different treatments
分析PC1、PC2上的优势碳源,结果如表4所示。以|r|>0.8计,31种碳源中共有13种对PC1贡献较大,分别是碳水化合物5种、氨基酸3种、羧酸2种、聚合物2种、酚酸1种;对PC2贡献较大的碳源共有5种,包括聚合物2种,碳水化合物、氨基酸、羧酸各1种。综合分析,碳水类、氨基酸类及聚合物类为不同生物质炭处理下对土壤微生物群落代谢特征起分异作用的主要碳源类型。N-乙酰基-D-葡萄胺、葡萄糖-1-磷酸盐、L-天冬酰胺酸与α-环状糊精在PC1 和PC2 上的载荷值均大于0.5,为最敏感的碳源。
表4 31种碳源的主成分载荷因子Table 4 Loading factors of principle components of 31 carbon sources
2.5 连作老参地土壤细菌群落结构丰度与多样性
采用高通量测序分析生物质炭处理后土壤细菌群落结构变化,结果如表5所示。与新林土相比,老参地物种数(operational taxonomi unit, OTU)、丰度(ACE指数、Chao1指数)、多样性(Shannon指数)均呈下降趋势。采用生物质炭对老参地进行改良后上述指标均有所上升,其中Chao1指数与ACE指数增幅最大,平均增幅分别达到25.05%、19.10%,表明生物质炭处理有助于老参地土壤中细菌物种丰度及多样性恢复,其中玉米秸秆炭及稻壳炭对上述指标影响较大。
2.6 连作老参地土壤细菌群落结构特征
分析不同土壤样品中细菌群落结构门类比例变化(表6),结果表明,新林土中优势门类(占比>10%)为变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门4门,其OTUs 所占比例为 OTUs 总量的76.75%以上;老参地中优势门类数量下降为2门,为变形菌门与放线菌门,其OTUs占比为65.39%,较新林土中二者占比增加了21.67个百分点;生物质炭处理后上述优势门类比例(54.51%~65.39%)有所下降。其次,5个样品中共检测到27个细菌门,共有门类21个,新林土门类最丰富(26个),与新林土相比,老参地土壤中3个细菌门消失(Fibrobacteres丝状杆菌门,Elusimicrobia迷踪菌门、Hydrogenedentes),增加了1个细菌门(Fusobacteria梭杆菌门)。添加生物质炭后,仅稻壳炭处理下迷踪菌门细菌数量有所恢复,其他消失细菌门类未检测到OTU数据。
表5 不同处理下土壤细菌丰度与多样性指数Table 5 Soil bacteria abundace and diversity indices of different treatments
与新林土相比,老参地中变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、Candidatus Saccharibacteria、Parcubacteria、Candidate division WPS-2中OTUs增加(增加比例1.84%~1 348.88%),增幅最大的为Candidatus Saccharibacteria、厚壁菌门;OTUs下降的门类包括酸杆菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、浮霉菌门、Chlamydiae、Candidate division WPS-1、unclassified,下降比例45.10%~88.10%,降幅最大的为Candidate division WPS-1和疣微菌门。3种生物质炭对老参地土壤中变形菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门、Candidate division WPS-1、unclassified菌种丰度变化均具有调节作用,使其数量变化趋势趋向于新林土。上述分析表明老参地土壤微生物群落出现种群单一化、单优势种群上升的特点,而生物质炭对上述变化趋势具有一定的调节作用。
表6 添加生物质炭对连作参地土壤细菌群落门类的影响Table 6 Effect of biochar treatment on bacterial community phylum changes of replanted ginseng soil
3 讨论
3.1 生物质炭对人参产量及土壤理化性质的影响
根是人参主要的入药部位,根重的累积量与Logistic增长曲线类似,一年至两年生人参种苗的根重增加缓慢,优质两年生人参种苗约为4~5 g[18]。有报道显示采用老参地栽培重茬人参,参根的生物量累积速度会显著下降,其单产仅为正茬人参的4.3%~14.2%[19-20]。本研究结果与之类似,老参地栽培的两年生重茬人参病害高发,掉苗严重,剩余人参种苗生长受阻,参根均重仅为0.5 g,远低于正茬优质种苗,表明老参地土壤不可直接用于人参重茬种植。将不同类型生物质炭用于老参地土壤修复后,两年生重茬人参参根重量达到1.92~3.30 g,平均提升384.91%,说明生物质炭处理有助于提高重茬人参生物量。
土壤肥力是土壤的本质属性,是保障药用植物生产的根本,直接影响药材的产量与品质。研究发现,野山参生长土壤的有机质、有效磷、有效钾含量高,有利于増加土壤团聚体含量,提高植物抗病能力,满足其多年生长对养分的需求[21]。随着栽培年限增加,农田栽参土壤的有机质、全磷等矿质元素不断下降,与野山参土壤肥力差异显著[22]。研究认为土壤有机质与多种土壤指标间存在相关性,增加土壤有机质含量,可显著提升人参产量并改善品质[23],磷与人参总皂苷、根重、根径均具有显著的正相关关系[24],二者是影响人参产量与品质的关键土壤因子,也是老参地土壤质量恢复的重要指标。本研究中,生物质炭处理稳定提升了土壤中有效磷与有机碳含量,二者增幅分别为47.04%~237.73%、8.09%~38.71%,表明生物质炭处理可能通过改善土壤中磷与有机碳的供给,提高参地土壤的供肥能力,从而促进人参生物量增加。而土壤中有效磷与有机质含量增加可能与生物质炭本身含有丰富的有机质及部分磷等养分元素有关[25-26]。也有研究认为在酸性土壤上增施有机物, 有机物分解产生的有机酸和其他螯合剂能将部分固定态的磷释放为可溶态,从而增加土壤中有效磷含量,同时有机酸与磷酸根竞争固相表面专性吸附点位,减少了土壤对磷的吸附固定,也可促进人参对有效磷的吸收[27-28]。
3.2 生物质炭对土壤微生物代谢活性的影响
土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分,在反映土壤质量变化中起着重要的作用,其种类、数量与功能多样性等受环境因子影响较大[29]。本研究显示,增施生物质炭后老参地土壤微生物活性显著增加,表明生物质炭可促进土壤微生物活性,这与高文翠等[30]的研究结果一致。原因可能与生物质炭含有的营养成分有关,施入土壤后可为微生物提供能量,促进微生物生长。研究认为,根区土壤微生物对氨基酸类、碳水化合物类、羧酸类、酚酸类、胺类等碳源的利用能力越强,土传病害越轻[31],说明增施生物质炭有利于提高老参地土壤的抗病性。
从六大类碳源利用情况看,老参地土壤微生物偏好碳源为聚合物类、羧酸类、氨基酸类,经生物质炭处理后土壤微生物表现为对聚合物类、酚酸类、氨基酸类碳源利用效率较高,其中以酚酸类物质为底物的功能微生物种群数量得到了显著提升,这与生物质炭对连作棉田根际土壤微生物功能结构多样性的影响结果类似[32]。有报道显示,土壤微生物对酚酸类物质利用程度与水稻化感作用变化呈显著正相关,诱导以酚酸类物质为碳源的微生物增加可提高水稻对稗草生长的抑制[33]。综合上述分析,增施生物质炭可促进土壤微生物活性,提高土壤中酚酸类碳源利用率,有助于提高重茬人参的抗逆能力,从而保证人参的正常生长。
3.3 生物质炭对土壤微生物群落结构的影响
据目前的研究,随人参连作年限增加,土壤中细菌数量呈减少趋势,土壤由细菌型向真菌型转变[34]。本研究采用高通量测序技术对比了新林土与老参地中细菌物种数量变化后也有类似发现,即老参地中物种数、丰度、多样性均呈下降趋势。采用3种不同生物质炭改良后上述指标均有所增加,表明生物质炭处理后老参地土壤细菌物种丰度及多样性有所恢复。这可能与生物质炭的多孔结构有关,其丰富的孔隙可以为多种微生物提供栖息地和避难所,有助于微生物的生长和增殖[35]。
一般而言,在细菌门级分类水平上,革兰氏阳性菌属于寡养型细菌,通常在贫营养环境下占优势(K-策略型),革兰氏阴性菌属于富养型细菌,通常在富营养环境下生长旺盛(R-策略型)。本研究中新林土中优势门类包括变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门,其中变形菌门细菌为R-策略型,可以利用不稳定碳源迅速生长,其余3门细菌为K-策略型,主要利用难分解的碳源,如纤维素、半纤维素等[36]。经过人参栽培后,新林土逐渐转化为老参地,土壤中变形菌门、放线菌门细菌数量增加,而酸杆菌门、疣微菌门细菌数量剧烈下降。研究认为老参地微生物群落的变化与人参根际分泌物的驱动密切相关[37-38]。人参根系分泌物中包括碳水化合物、氨基酸和有机酸等,可引发多种反应,参与塑造根际微生物组。其中某些特殊分泌物可直接吸引或排斥某类微生物,从而驱动根际微生物组的建成[39]。新鲜的有机分泌物中富含多种可溶性有机碳(dissolved organic carbon,DOC),输入到土壤中可以刺激变形菌门细菌的活性,产生激发效应而迅速增殖[40]。酸杆菌门是土壤微生物中的重要类群,多为嗜酸菌,适合在酸性环境中增殖,但生长速度较慢[41]。研究发现,未被扰动的森林土中酸杆菌门丰度最大,当土壤营养结构等发生变化时,生长较快的微生物将取代酸杆菌门,导致其丰度降低[42]。这也可能是老参地中酸杆菌门细菌数量降低的主要原因。疣微菌门可降解土壤中的顽固性有机物,有研究表明疣微菌门细菌丰度与土壤DOC 呈负相关[43],也有研究认为疣微菌门细菌丰度下降与土壤中N过量有关[44]。采用生物质炭对老参地土壤进行改良发现,3种生物质炭对土壤细菌门级结构影响不同,但均对变形菌门、疣微菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门等菌种丰度变化具有调节作用,使其数量变化趋势趋向于新林土。本试验中采用的3种生物质炭来源于3种不同的原料(玉米秸秆、稻壳、椰壳),但制备成生物质炭后具有2个共同点,即pH值为碱性和含有大量有机质。其中大量难分解的有机碳施入土壤中后可以稀释DOC,使变形菌门细菌数量增加趋势减缓,同时刺激疣微菌门细菌生长。而芽单胞菌门丰度与土壤pH值呈正相关关系[45],碱性的生物质炭加入土壤中可提高土壤pH值,有助于芽单胞菌门细菌数量的增加。
综上所述,生物质炭可提升土壤有机质与有效磷含量,促进微生物对碳源的利用,增加土壤细菌丰度,调控细菌群落结构使其趋向于新林土的分布与比例,对老参地土壤体现出良好的修复、改良作用。但生物质对上述指标影响的程度、机理及指标的响应顺序等问题还存在很多不确定性,究竟是由于生物质炭先改良了土壤环境,进而刺激了微生物多样性,还是生物质炭首先刺激了对环境敏感的微生物活性,而后推动了土壤质量的持续改良[46],亦或是二者同时进行,尚未有明确的结论,需要更多的研究加以说明。
4 结论
本研究结果表明,施用生物质炭可促进两年生连作人参生物量与总皂苷含量增加,改善老参地土壤中速效磷与有机质的养分供应,提升土壤微生物代谢活性及对酚酸类碳源的利用程度。增施生物质炭后,老参地土壤细菌的物种丰度、多样性指数与物种数量均呈趋向于新林土的变化趋势。适量增施生物质炭有利于老参地土壤质量的调节与恢复。