邻香兰素对黄曲霉生长的抑制作用研究

赵 颖，李 倩，朱晓嫚，谢岩黎

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

黄曲霉属真菌门、半知菌亚门，是一种常见腐生真菌，多见于发霉的粮食、粮食制品及其他霉腐的有机物。作为一种致病真菌，黄曲霉的危害主要包括：黄曲霉菌侵染人畜，导致曲霉病；黄曲霉菌产生的次级代谢产物黄曲霉毒素(AFT)具有强毒性和强致癌性，严重危害人体健康，污染粮食作物[1]。黄曲霉毒素超标导致的粮油产品安全事件时有发生[2]。杨博磊等[3]对湖北黄冈花生的污染情况进行检测，发现产后其黄曲霉毒素B1(AFB1)检出率为57%，超标率为10%。陈丽媛[4]对2018年1—6月饲料进行检测，发现AFB1检出率为100%，其中最高值为79.55 μg/kg。鉴于黄曲霉及其毒素的严重危害，防霉控霉在我国粮食加工、运输及储存过程中极为重要。

对于黄曲霉的防控，目前有效的措施有：微波、辐射、光调控抑菌等物理方法[5]，使用合成化学防霉剂如富马酸二甲酯、丙酸、盐类、苯甲酸等化学方法[6]，筛选抗黄曲霉的微生物及其代谢产物等生物方法[7-8]。植物天然产物具有抑菌活性的有柠檬醛、肉桂醛等[9-11]，具有安全可靠、成本低等优点，具备被开发为天然抑菌剂的潜力[12]，是抑菌研究的热点之一。

香兰素及其衍生物具有显著的抑菌活性[13]，其中，邻香兰素的研究取得了初步的成果。邻香兰素(2-羟基-3-甲氧基苯甲醛)广泛存在于红松果[14]和腊菊属[15]等植物的提取物中。在抑菌方面，邻香兰素对烟曲霉、土曲霉、黄曲霉、扩展青霉和新生隐球菌均具有抑菌作用，最小抑菌浓度(MIC)分别为76、76、152、152[16]和4 μg/mL[17]。前期研究发现邻香兰素对黄曲霉的MIC为100 μg/mL[13]，本研究将进一步探索邻香兰素对黄曲霉发挥抑制作用的方式并评估其在食品中的抑菌效果，以期为未来天然抑菌剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄曲霉菌株3.6304：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；邻香兰素：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，溶于99%的无水乙醇，配制好的邻香兰素稀释液储存于4 ℃冰箱；大米：黑龙江五常京贡米粮食品有限公司；葵花子：市售。

将真菌在沙氏琼脂培养基(SDA：4%葡萄糖、2%琼脂和1%蛋白胨)上于(28±2) ℃培养1周待用。在沙氏培养基(SDB：4%葡萄糖和1%蛋白胨)中培养用于试验的菌丝体。试验用水为一级超纯水，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204型电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SW-CJ-2D型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；PYX-DHS-40X50-BS型隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；THZ-92B型气浴恒温摇床：上海诵诚实业发展有限公司；BM-37XBC型倒置生物显微镜：上海彼爱姆光学仪器制造有限公司；DFC 7000 T型正置荧光显微镜：德国徕卡；UV-6100 S型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；DZS-706-C型多参数分析仪：上海雷磁仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 对邻香兰素作用下孢子萌发情况的观察

1.3.1.1 孢子悬浮液制备

取黄曲霉生长1周左右的培养皿，倒入适量无菌生理盐水，并用涂布器均匀涂布培养基表面，随后用滤纸过滤，所得滤液即为孢子悬浮液。用血球计数板计数，通过计算，调整孢子密度为5×105个/mL。

1.3.1.2 邻香兰素对孢子萌发的影响

向所得孢子悬浮液中加入邻香兰素稀释液，浓度梯度选取参照Li等[13]的方法。随后静置于恒温培养箱(28±2) ℃培养6 h。用枪头吸取适量悬浮液于载玻片，在油镜下观察不同质量浓度邻香兰素处理下孢子形态差异。

1.3.2 邻香兰素对黄曲霉孢子呼吸代谢影响的测定

邻香兰素对黄曲霉孢子呼吸代谢影响的测定参考Li等[18]的方法。

1.3.3 邻香兰素对黄曲霉菌丝细胞膜的影响

1.3.3.1 细胞膜完整性试验

参考Ouyang等[19]的方法。取50 μL(5×105个/mL)新鲜配制的黄曲霉孢子悬浮液于10 mL SDB中，置于恒温培养箱(28±2) ℃培养24 h。加入邻香兰素使其终质量浓度达到25、50、100 μg/mL，未加邻香兰素的为对照组。继续培养0、4、8、12 h后，取少量菌丝样品滴在载玻片上，PBS冲洗两遍，加入一滴PI染料(1 μL/mL，索莱宝生物科技有限公司)，避光静置20 min，再次用PBS冲洗两遍，滴加抗荧光淬灭剂(上海生工生物工程有限公司)，然后于荧光显微镜下观察并对荧光强度进行定量分析。

1.3.3.2 细胞核酸释放含量的测定

参考周海恩[20]的方法。不同质量浓度邻香兰素处理0、4、8、12 h后，取2 mL混合物于8 000g离心10 min，取上清液于260 nm处测吸光值。SDB校准空白。

1.3.3.3 相对电导率和胞外pH值的测定

参考Gao等[21]的方法。依次测定加入邻香兰素4、8、12 h后不同质量浓度组的菌丝电导率和pH值。最后，将上述菌丝沸水浴5 min，冷却至室温后测定最终电导率。根据以下公式计算相对电导率。

式中：C1和C2分别代表样品沸腾前后的电导率；Cw1、Cw2分别代表纯水沸腾前后的电导率。

1.3.4 邻香兰素的体外抑菌作用

1.3.4.1 对储存大米中黄曲霉的抑制作用

邻香兰素对储存大米中黄曲霉的抑制试验参考Tang等[22]的方法并稍加修改。试验所用大米预先用1%次氯酸钠溶液灭菌30 min，无菌水冲洗3～5次，于超净工作台内吹干，并紫外照射30 min。称取2 g左右预处理过的大米，规范放置于培养皿(d=3.5 cm)中。将新鲜的黄曲霉孢子悬浮液(5×105个/ mL)与邻香兰素以0、25、50、100 μg/mL的终质量浓度均匀混合。取20 μL上述孢子-邻香兰素混合物，与大米混合均匀。用封口膜对培养皿封口，然后置于恒温培养箱(28±2) ℃中，拍照记录培养24、48、72 h大米表面黄曲霉菌的生长情况。

1.3.4.2 对葵花子中黄曲霉的抑制作用

邻香兰素对储存葵花子中黄曲霉的抑制试验参考1.3.4.1。污染率指受黄曲霉污染的葵花子粒数占全部葵花子粒数的百分率。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 20.0、Origin 2017和ImageJ软件进行数据处理和作图，所用试验至少进行3次，结果以平均值±标准差表示。通过邓肯多重检验确定组间的显著差异，当P<0.05时差异显著。

2 结果与分析

2.1 邻香兰素作用下孢子萌发情况分析

已知黄曲霉孢子的正常萌发时间为6 h，图1清晰展示对照组(无邻香兰素处理)黄曲霉孢子体积明显膨大(虚线圈)，并且以此结构为起点(黑色箭头)，从一端开始延伸，并且有弯曲结构出现(弯曲箭头)，形成早期菌丝体。菌丝体中不同的细胞结构隐约可见。不同质量浓度的邻香兰素处理组均未发现孢子萌发，依旧是球形的孢子。孢子表面具有疏水性，当孢子仅由于重力作用不均匀沉降在培养皿表面，并未发生实质黏附，因此，孢子边缘具亮圈。总之，本试验从形态学上展示了早期孢子的萌发，证实了邻香兰素对孢子萌发的抑制作用。

注：图中观察倍数相同，只标注于其中之一图中。图3同。

2.2 邻香兰素作用下孢子呼吸代谢的变化

由图2可知，未加邻香兰素的对照组在培养期内，其溶解氧含量在6.25～6.72 mg·L-1范围内波动，而25、50、100 μg/mL 3个处理组的溶解氧含量在5.72～6.89 mg·L-1范围内波动。由此可见，无论邻香兰素质量浓度高低，在12 h的作用时间以内，黄曲霉孢子外的溶解氧含量均保持稳定，这表明邻香兰素处理的黄曲霉孢子在呼吸作用中消耗氧气量并无显著变化。延长邻香兰素的作用时间是否会抑制甚至破坏呼吸作用有待进一步的研究。

图2 邻香兰素对黄曲霉孢子氧气消耗量的影响

2.3 邻香兰素作用下黄曲霉菌丝细胞膜的变化

2.3.1 邻香兰素对黄曲霉菌丝细胞膜完整性的影响

PI染色结果如图3a所示，用邻香兰素处理的菌丝体发射红色荧光，并且随着邻香兰素质量浓度和处理时间的增加，荧光强度增加。由图3b可知，在12 h内，对照组菌丝荧光强度基本没有变化，均接近0。当邻香兰素的质量浓度为25 μg/mL时，PI荧光强度开始增强，4、8、12 h时分别是0 h的2.36、4.46、5.01倍。当邻香兰素的质量浓度为50 μg/mL时，4、8 h时的荧光强度与25 μg/mL时的接近，12 h时则明显增高，为0 h时的9.42倍。当邻香兰素的质量浓度为100 μg/mL时，PI荧光强度则在8、12 h时显著变化，依次增高了12.82%和20.00%，说明邻香兰素破坏菌丝细胞膜完整性，且这种破坏作用在50 μg/mL 处理12 h和100 μg/mL 处理8 h时开始显著增强 (P< 0.05)。在Li等[23]的研究中，邻香兰素处理24 h之后，黄曲霉菌丝细胞膜仍遭受明显损伤，且这种损伤在MIC时尤为显著。以上结果说明邻香兰素对黄曲霉细胞膜存在持续的破坏作用。

注：不同小写字母表示存在显著差异(P<0.05)。表1同。

2.3.2 邻香兰素作用下黄曲霉菌丝细胞核酸的释放

由表1可知，在邻香兰素不同质量浓度下，0、25 μg/mL时 OD260在处理12 h内的变化并不显著，当邻香兰素的质量浓度不低于50 μg/mL时，随着处理时间的延长吸光值呈现显著升高的趋势。与0 h相比，在处理时间为4、8、12 h时，50 μg/mL质量浓度组的吸光值依次增加了3.23%、9.68%、19.35%，100 μg/mL质量浓度组的吸光值依次增加了74.19%、90.32%、100.00%。结果表明，在邻香兰素的作用下，核酸渗出了完整性受损的细胞膜。

表1 邻香兰素对黄曲霉菌丝细胞核酸释放的影响

2.3.3 邻香兰素作用下黄曲霉菌相对电导率和胞外pH值的变化

如图4a所示，0 h时，对照组和邻香兰素处理组的胞外相对电导率在7.37～7.96范围内。正常的黄曲霉菌丝胞外的相对电导率有轻微的升高，这是细胞内外的渗透压差导致的，邻香兰素处理显著提高了胞外相对电导率。当质量浓度为25、50 μg/mL时，4、8、12 h的相对电导率分别为8.50%、11.19%、11.81%和9.25%、11.65%、12.19%。经比较，同样的处理时间时，两质量浓度组相对电导率接近。100 μg/mL的邻香兰素处理组相对电导率发生了更显著的升高，4、8、12 h依次增加了28.83%、30.92%、44.24%。结果表明，邻香兰素对黄曲霉细胞膜的破坏作用呈现质量浓度和时间依赖关系。由图4b可知，对照组在培养24 h后呈现中性，pH值约7.58，随着培养时间的延长，pH值逐渐降低到约6.22，然后到12 h时趋于稳定，表明细胞分泌了更多的酸性物质。对于邻香兰素处理组，随着处理时间的延长，pH值也呈现降低的趋势，且相同的时间点时，pH值较对照组更低，表明邻香兰素的处理使更多的酸性物质渗出。综上所述，相对电导率和胞外pH值的变化说明邻香兰素破坏了黄曲霉菌细胞膜的稳定性，导致膜通透性增加，从而造成离子泄露、酸性物质渗出。

图4 邻香兰素对黄曲霉菌丝相对电导率和胞外pH值的影响

2.4 邻香兰素的体外抑菌作用

2.4.1 邻香兰素对储存大米的抑菌作用

如图5所示，对照组大米在48 h时呈现轻微黄绿色，72 h时黄曲霉菌继续增长，污染颜色加深，污染表面积增大。与对照组相比，25 μg/mL质量浓度邻香兰素处理后，大米在48 h时出现极少量白色菌丝，72 h时白色菌丝几乎铺满表面，且少量菌丝开始呈现黄绿色。50 μg/mL质量浓度邻香兰素处理后，仅在72 h时观察到大米表面极少量的黄曲霉污染。100 μg/mL质量浓度的邻香兰素处理72 h内，大米未被黄曲霉污染。这说明邻香兰素在72 h内、100 μg/mL时能够有效抑制黄曲霉对大米的侵染。

图5 黄曲霉在邻香兰素处理前后大米表面的生长情况

2.4.2 邻香兰素对葵花子的抑菌作用

如图6所示，对照组葵花子在24 h时无污染迹象，在48 h时葵花子表面出现白色菌丝，72 h时黄曲霉继续侵染，此时黄绿色的菌丝完全包裹葵花子。与对照组相比，25 μg/mL质量浓度邻香兰素处理后，葵花子在48 h时开始出现少许白色菌丝，72 h时菌丝颜色加深，呈黄绿色；50 μg/mL质量浓度邻香兰素处理后，48 h时黄曲霉生长形态与同时间25 μg/mL质量浓度组相似，但72 h时黄曲霉大多仍处于白色菌丝状态。100 μg/mL质量浓度邻香兰素处理72 h，葵花子均未被黄曲霉污染。污染率定量结果表明，24 h时，对照组和邻香兰素处理组的污染率均为0，48 h时，对照组和邻香兰素处理组的污染率为100%、100%、95%、0。72 h时，仅100 μg/mL组污染率为0，其他均为100%。这说明邻香兰素在72 h内、100 μg/mL时能够有效防控黄曲霉对葵花子的侵染。

图6 邻香兰素处理前后黄曲霉在葵花子表面的生长情况

3 结论

作为一种天然产物，邻香兰素被广泛应用于食品和制药，但对其抑菌机制研究较少。本研究发现，邻香兰素处理12 h能够显著抑制黄曲霉孢子萌发和破坏菌丝细胞膜完整性，导致细胞内容物的渗出，抑制黄曲霉增殖，但对呼吸作用影响很小。此外，邻香兰素能够有效抑制黄曲霉对大米和葵花子的侵染，该结论具有实际意义，可进一步将邻香兰素作为一种天然抑菌剂拓展至粮食及农产品的防霉控霉领域。