基于原子力显微镜技术的食品科学研究进展

郭云昌，刘钟栋

1.仪凰(无锡)光谱测控有限公司，江苏 无锡 214446

2.河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscopy，STM)[1]的问世，使物质二维表面上的单个原子及其排列状态能直接被观察到，STM对涉及表面物理学的各个研究领域有重要意义[2-3]。但是，由于STM的应用局限于导体，不能对绝缘样品进行检测和力学操纵，所以很快发展出可以检测绝缘体和半导体的原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)[4]。STM的发明和AFM各种模式的发展，逐渐形成一类基于探针扫描的显微镜(scanning probe microscopy，SPM)，更广泛应用于包括导体、半导体、绝缘体材料在内的形貌学、力学、电学、磁学等物理学性能表征[5-9]。本文就原子力显微镜的原理、优势及其在食品科学领域中的淀粉、蛋白、脂类以及其他方面的应用进展进行综述。

1 原子力显微镜的工作原理

原子力显微镜的工作原理如图1所示。一个长度约为100 μm的力学敏感的微悬臂，其末端具有纳米级曲率半径的针尖。特定波长的激光照射到微悬臂背面的反射层，反射到探测器(PSPD)上。针尖在样品表面扫描时，针尖和样品表面之间的相互作用力随着样品形貌变化或物理性质的不同而发生变化，这种变化引起了微悬臂的偏折，激光检测微悬臂的偏折就可以得到所扫描样品表面的形貌学信息，获得图像、力学数据。原子力显微镜以相互作用力作为反馈信号，其应用领域已经不局限于样品是否导电，也不局限于工作环境是否真空，从而大大拓宽了研究对象，它可以在大气、真空和溶液等环境下对导体、半导体、绝缘体等物质表面特征进行测量，还可以进行原位、动态、实时研究显微成像，表征样品表面的微结构(原子、分子级别)信息，如形貌学、力学、电学、磁学等综合物理信息。实验中，原子级曲率半径的针尖的获得，使原子级的成像分辨率得以实现。AFM的表征能力已经强大到可以表征单个原子、单个分子；AFM作为一种“力”显微镜，除了可以利用原子间力外，还可以利用针尖给样品施加纵向和横向的作用力，结合AFM的不同工作模式，对样品进行定位纳米操纵。AFM能够最大程度保证试样在观察时不会因为干燥、抽真空、导电或染色处理而被破坏，并能实现原位实时分析和定位纳米操纵。食品科学的基础研究就是要保证研究样品保持一个初始的自然状态，因此，AFM在物理、化学、生物、食品等科学中的应用就越来越广泛。

图1 原子力显微镜工作原理

2 原子力显微镜技术在食品科学中的应用

2.1 淀粉

淀粉是一类重要的碳水化合物，是由葡萄糖单元构成的多糖，淀粉按照性质是否稳定，是否易于分解，可以分为难以分解的直链淀粉和易于分解的支链淀粉2类[10]。近日，中国科学家[11]首次在实验室成功“种”出淀粉。淀粉的微观结构一直是科学家感兴趣的研究对象。淀粉作为一种重要的生物多糖类大分子，其结构研究已经经历了100多年的发展。偏光显微镜、扫描电镜等[12-15]在研究淀粉颗粒的晶体结构和颗粒大小方面取得了一定的成果。20世纪80年代，由于原子力显微镜具有可以在生理条件下研究样品三维形貌的优点，迅速地被应用于研究淀粉[16-18]。在原子力显微镜下，淀粉的微观结构研究又有了新的进展。Thomson等[16]利用AFM研究淀粉颗粒表面酶的使用效果，淀粉颗粒逐渐被酶的作用从外到内打开了一个通道。1998年法国的Baldwin等[17]用AFM也观察到淀粉颗粒表面的拓扑形貌。但是他们的研究与电镜下淀粉的研究一样，还停留在颗粒(granule)的基础上。

淀粉的结构研究已经取得了很大的进步，但是在从微观到纳观层次方面的研究进展还是不够顺利。近些年，原子力显微镜技术和制样技术的发展，有力地推动了淀粉纳观层次结构的研究。刘钟栋课题组[19-20]利用原子力显微镜对淀粉在纳观层次的结构进行研究，利用纳米操纵技术作为淀粉结构研究的一个新起点，首次获得原子层面的淀粉“链”的图像证据。借助于“分子梳”操纵技术[21-22]，利用AFM对沉积在新解离的云母上的天然淀粉、变性淀粉以及酶解淀粉进行了深入研究。研究结果显示，链淀粉中存在线性的长链，它是葡萄糖单链有规律的缠绕，长度为1～2 μm，链径为10～20 nm，同时还发现了更细的链，链径在1.5 nm左右。图2A展示了一根似乎正在从淀粉颗粒中往外“逃逸”的淀粉直链。直链淀粉在水溶液中的无规则线团构型在图2B中被直接观察到;支链淀粉在溶液中呈现出糜状和菊花状的构型，这从图2C中也得到了印证；进一步地研究发现天然淀粉颗粒中稳定存在20 nm左右直径的纳米级微粒子(图2D)[20]，它可能是目前人们未知的淀粉在纳米层次的形态丰富多样的一个基本结构单元。受到分辨率的限制，此前，人类一直只能在微米尺度观察淀粉形貌，在更小的介观尺度，都是以酶解淀粉后的单糖数据“猜想”淀粉的链结构。因此，在淀粉领域的研究说明：AFM仪器的技术进展，使形态科学在分辨率方面提高了一个数量级。同时，可以揭示许多难以想象的介观结构。

A 显示一根正在往颗粒外游离的直链淀粉； B为淀粉的无规则线团构型; C为支链淀粉的糜状结构； D为淀粉纳米粒子

2.2 蛋白类

食品工业中蛋白种类繁多，AFM也广泛应用于各类蛋白的表面形貌和物理特性研究，比如麦谷蛋白[23]、面筋[24]、玉米醇溶蛋白[25-26]、乳清蛋白[27]、胶原蛋白[28]、酪蛋白[29-32]、大豆蛋白[33-34]等。选取2种极具代表性的蛋白进行举例说明AFM在食品蛋白中的应用。玉米醇溶蛋白具有很强的疏水性，水溶性差，可以溶于乙醇，疏水氨基酸和含硫氨基酸占有很高的比例，蛋白质分子间以较强的二硫键、疏水键相连[35]，这也是玉米醇溶蛋白的成膜基础。玉米醇溶蛋白可作为生物可降解塑料、涂膜剂、黏结剂、药物缓释材料和营养辅料等。玉米醇溶蛋白的这些特性不仅仅与它的氨基酸种类和比例紧密相关，还依赖于它的单体聚集程度和结构。一直以来，人们研究玉米醇溶蛋白的结构与性质时，基本的研究手段都是像X射线散射、超滤、双折射以及圆二色谱等这样的常规的物理手段。Tatham等[36]通过小角X射线散射和黏度分析表明，玉米醇溶蛋白的分子不对称，主要为α-螺旋构象。但是，人们很少直接观察到更精细的纳米结构。在原子力显微镜下，Guo等[37]研究了玉米醇溶蛋白更精细的微观结构。在70%乙醇溶液里，玉米醇溶蛋白是以一定聚集态存在，呈现出大小集中在15～50 nm之间的小球，如图3A所示。前面已经了解到玉米醇溶蛋白容易成膜[38]。借助于改进的“分子梳”制样技术[19-20]，进一步研究玉米醇溶蛋白的成膜特性[25]，在实验中观察到直径约为8 nm的短棒(图3B)，这些弯曲的短棒结构相互交织成一张均匀大网，在大网的缝隙中，还存在为数不少的游离状态的颗粒，这也许是制样过程造成的或者本身就存在这种更小的纳米级颗粒，这些网状结构对玉米醇溶蛋白成膜特性给予了支持。当样品表面湿度降低时，同时降低作用在样品表面的作用力时，“网眼”显得更密，尺寸在50～100 nm之间(图3C)，这也证明了玉米醇溶蛋白膜具备优良的防水透气特性。

A为醇溶蛋白纳米小球； B为醇溶蛋白棒状、环状结构和游离颗粒； C为醇溶蛋白网状结构

胶原蛋白是动物体内最丰富的蛋白质，存在于大多数组织中。它的纤维特性意味着胶原蛋白为组织增加了结构、强度和弹性。因胶原蛋白在生物相容性、可降解性以及生物活性方面的良好性能，其广泛应用在食品、医药等领域[39-42]。胶原蛋白可分为很多种类，其中I型成纤维胶原应用较广，直径约1.5 nm，由3条多肽链以超螺旋的方式相互缠绕，组成4～5 nm的胶原纤维，分子长度可达300 nm，呈现出棒状结构[43]。胶原蛋白的自组装过程(与组织培养、改性、加工密切相关，如人造肉)目前不是完全清楚。因此，确定I型成纤维胶原形成的实时动力学研究对于更好地理解I型胶原的结构和功能至关重要，但在分子尺度上可视化I型胶原的动态自组装过程需要提供高时空分辨率的成像技术。快速扫描原子力显微镜提供了在接近生理条件下以秒为时间尺度研究这些过程的手段。Stamov等[44-45]用超快速原子力显微镜实时研究了I型胶原蛋白原纤维生长，研究了在30 μg/mL的总胶原单体浓度下I型胶原原纤维在50 mmol/L的甘氨酸缓冲液(含200 mmol/L KCl，pH 9.2)中卷曲状原纤维4 h内的形成过程[44]。原子力显微镜下明显观察到一个纤维的形成过程，表明在前述条件下，纤维排列和取向变化随时间而变化，4 h后纤维几乎覆盖整个表面。Cisneros等[46]用原子力显微镜研究了如何控制I型胶原原纤维在纳米基质上组装成不同的花样。这些超薄(～3 nm)基质中的胶原原纤维保持了体内观察到的天然结构。这为利用胶原结合蛋白或与胶原结合域融合的蛋白质创建可编程生物功能化基质开辟了可能性；应用于真核细胞，这些纳米结构的基质可以引导细胞过程，如黏附、定向和迁移等。

对于生物来讲，DNA和蛋白质的相互作用是至关重要的，根据中心法则[47]，遗传信息从DNA经RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译过程。原子力显微镜在DNA或RNA方面的研究已经比较深入了。Lv等[48]、Hu等[49]利用原子力显微镜的探针对DNA进行“分子手术”，对DNA分子进行精准定位、切割、移动、折叠等纳米操纵，接着对感兴趣的部分进行拾取，然后进行PCR扩增，得到目标DNA片段的碱基序列，这是基于原子力显微镜的物理手段(DNA的单分子纳米操纵)与生化分析相结合的新研究手段。Hu等[49]以改性的云母为衬底，用“分子梳”方法制样，AFM探针作为“手术刀”对云母片上的DNA分子进行“分子手术”后，书写“D”“N”“A”3个字母。

2.3 脂类

脂类包括脂肪和类脂，是人体重要的营养成分。科学家们已经利用AFM对脂类与纳米乳液体系的关系和影响进行了表征[50-52]。纳米乳液是由2种互不混溶液体组成的各向同性分散系统，通常由分散在水系统中的油系统或分散在油系统中的水系统组成，形成纳米尺寸的液滴或油相，一般在1～100 nm。研究人员用AFM研究了脂类的结构、表面形貌以及对其他成分的结构和功能性的影响[51,53-55]。Lupi等[51]研究了在制备有机凝胶时，溶剂特性对有机凝胶流变性和物理化学性质的影响，并比较了葵花油有机凝胶、米油有机凝胶、石蜡油有机凝胶、蓖麻油有机凝胶的表面形貌，AFM显示这几种有机凝胶表面形貌差异较大。Tai等[56]用AFM研究了甾醇衍生物对大豆和蛋黄卵磷脂脂质体的影响，研究表明，与空白脂质体相比，甾醇的加入增加了囊泡的尺寸。

Drolle等[57]研究了胆固醇对人工磷脂膜与淀粉样蛋白B肽(Aβ)相互作用的影响。通过原子力显微镜，证明了Aβ与富含20%胆固醇的DOPC双层的结合，导致了一个有趣的非均匀小岛的形成。他们将这种效应归因于DOPC双层中胆固醇诱导的纳米级静电畴的存在。AFM家族中的调频开尔文探针显微镜能够分辨出DOPC单层中的这些纳米级静电畴。这些发现直接影响了人们对胆固醇的存在如何诱导淀粉样沉积与生物膜的靶向结合的理解。Drolle等[57]研究了纯DOPC单层和含20%胆固醇的DOPC单层的AFM形貌图像与表面电位分布的对应FM-KPFM图像。研究发现，富含胆固醇的区域在形貌上较高，但电位较低。纯DOPC脂质单层光滑且具有均匀的无特征表面电位，而含有20%胆固醇的DOPC脂质单层在形貌和表面电位中显示畴结构。在KPFM图像中这些畴结构的表面电位差为(61±8) mV。考虑到Aβ的带电性质，由胆固醇在DOPC类脂膜中产生的静电畴会吸引Aβ肽，从而导致非均质岛或密集堆积淀粉样沉积物的微观区域。因此，可以改变带电或极性生物分子与脂膜表面的相互作用。这项工作证明了胆固醇的静电效应可能是淀粉样蛋白与脂膜结合的驱动力，从而支持胆固醇参与淀粉样蛋白毒性机制的假设。

An等[58]用AFM的力体积曲线谱研究了胆固醇对脂阀门的力学性质的影响。在由DOPC/DOPS组成的双层磷脂膜中，在加入鞘磷脂(SM)后形成脂阀，DOPC/DOPS/SM为1∶ 1∶ 2，然后混入10%的胆固醇，形成含胆固醇的脂阀。AFM力体积曲线谱一方面可以对表面成像，获得表面形貌，另一方面又可以用来对表面做力学性质研究。这样可以将某个特定位置的力学性质与表面形貌对应起来。结果表明，不含胆固醇的磷脂双层在富含鞘磷脂的区域刚性大于不含鞘磷脂的区域。在加入胆固醇后，表面形貌显示区域界线变得模糊，黏附力没有差别，但是刚性变小，在富含鞘磷脂的区域刚性小于不含胆固醇的值，但是大于DOPC/DOPS磷脂双层。这项研究表明胆固醇在介导细胞膜表面有力学性质的作用。由于其在磷脂双层中处于一种可移动的状态，可以动态地调节脂阀与蛋白质以及其他大分子的相互作用。

2.4 其他应用

除了以上提到的三大类应用，AFM还在食品科学的其他领域得到了广泛的应用。Yang等[59-60]利用AFM研究不同储藏条件对果蔬表皮粗糙度的影响。他们的研究表明，储藏时间的延长和温度的升高会造成果蔬表面粗糙度的线性上升，并能有效表征不同储藏阶段果蔬的失水程度。Yang等[61-63]还利用AFM研究了不同储藏条件下黄桃果胶的链降解情况，调整冷藏条件可以抑制黄桃中果胶的降解。Xin等[64]研究壳聚糖涂膜对甜樱桃非等温贮藏过程中软化和碳酸钠可溶果胶(SSP)生成的抑制作用时，原子力显微镜图像显示，包衣甜樱桃含有更多的链接、分支和长SSP链，并保持果胶主链的宽度(N140 nm)。这些结果表明，壳聚糖涂膜在非等温条件下保存采后水果是可行的。这些研究是AFM技术直接用于指导果蔬的储藏，甚至加工工艺。

Xin等[65]研究了鸡皮明胶(CG)、商品猪皮明胶(PG)和罗非鱼皮明胶(FG)的凝胶性质和纳米结构，原子力显微镜结果显示，CG含有比PG和FG(直径分别为334、224 nm)更大的球形聚集体(直径为483 nm)，而缺少可以形成致密刚性凝胶的链状和环状结构。这些结果表明，分子内氢键和聚集行为是3种来源的明胶凝胶性质不同的基本原因。该项研究为鸡皮明胶作为商业明胶替代品的应用提供了指导，也为鸡皮明胶的改性提供了理论依据。Zhao等[66]研究了鱼明胶(FG)与葡萄籽提取物(GSE)在冷藏罗非鱼鱼片上的作用，原子力显微镜研究显示FG-GSE涂层通过保持其长度、宽度和高度来维持肌原纤维纳米结构，他们发展了一种用真空浸渍结合FG和GSE的协同效应的方法保存鱼片的方法。Chen等[67]在研究微热处理和乳酸及其组合对大肠杆菌的灭活效果时，AFM结果表明，湿热处理导致的外膜破坏导致大肠杆菌失活使细胞表面更加光滑，并导致外膜损伤。本文认为湿热处理和低浓度乳酸的组合可能是一种潜在的抗菌方法。

中国酿酒文化历史悠久，仅白酒种类就数不胜数，长期以来白酒的风味、口味鉴别长期以来依赖于人们的感官来判断，主观性大。有科学家尝试用物理方法来研究白酒的纳米图谱。邓少平[68]、赵金松等[69]用原子力显微镜研究了不同品牌白酒，发现了中国白酒微观非均相分布现象；在原力显微镜的微观世界里，不同风味的各类白酒，均存在有一定规律形态和尺寸大小的纳米颗粒，但是在假酒里面，要么颗粒大小毫无规律，要么几乎不存在纳米颗粒。白酒AFM纳米图谱的发现和图谱库建立，为白酒风味的鉴别、真假白酒的鉴别提供了一个新的研究方向。如果继续深入研究原材料、温度、生产工艺对纳米图谱形状和大小的相互关系，对白酒品质的提高无疑可以提供另外一种脱离人工主观评断的新方法。

3 展望

原子力显微镜发明至今，在许多领域都有很好的应用，在食品科学中的表征和动力学研究只是其中很少的一部分。现在的应用也主要集中在原子力显微镜众多物理探测手段中的成像功能，还可以考虑广泛引入原子显微镜力学、电学、磁学、热学测量等功能在食品科学中的应用。比如利用原子力显微镜的力学功能，可以研究胶原蛋白在针尖的力学作用下，缓冲溶液中改变或干扰结晶的重要过程；针尖诱导DNA在缓冲溶液中形成不同的花样等；前述提到胆固醇对脂阀门的力学性质影响，同样也可以利用原子显微镜的电学功能，改变胆固醇的电位，研究两者之间在电流或者静电力作用下的相互影响。生物微磁与人类健康息息相关，原子力显微镜已经发展到可以无侵扰地研究样品表面的自旋分布图像，利用该功能研究细胞内部的铁蛋白，无疑会大大拓展食品科学在疾病机理研究和诊断中的应用。原子力显微镜毕竟是一种物理的探测手段，还不能探明物质的分子结构和化学信息。现在原子力显微镜与激光拉曼光谱仪已经开始联用，利用基于原子力显微镜的针尖对激光拉曼光谱仪的电磁场增强作用——针尖增强拉曼光谱(tip-enhanced raman scattering，TERS)，它不仅可以同时获得物质的物理信息，也可以获得物质表面的分子结构和化学信息，而且将拉曼光谱仪的空间分辨率从亚微米级别提高到单分子水平。在研究醇溶蛋白的成膜机制时，如果在表征醇溶蛋白的物理特性的同时将拉曼表征引入，就能更好地分析这种成膜的化学特性：与蛋白里面的氢键、二硫键等的密切联系，这可能是一个非常有趣的研究方向。同样在研究果蔬的储藏变化时，引入拉曼光谱仪，就可以原位实时知道是某一组分的变化导致果胶以及失水率的变化。在研究白酒纳米图谱时，实时用TERS技术，可以原位了解是何种不同成分或水-乙醇分子团导致的纳米图谱的形状和大小不一样。作为一种直接的光学传感技术，TERS有可能成为DNA/RNA以及其他重要生物聚合物(如多糖、多肽，甚至糖肽结合物)的下一代测序方法。基于原子力显微镜的众多技术，特别是纳米拉曼光谱技术，应用在食品科学研究中，必将对食品科学的几何-化学键基础理论和应用研究起到极大的推动，甚至在食品开发、工艺过程改善、产品质量控制等方面都会发挥更大的作用。