云南地方品种小黄姜快繁技术研究

杨清松 韦献雅 杨青 王应梅 陶永宏

（1.云南省文山壮族苗族自治州农业科学院 云南文山 663099；2.成都农业科技职业学院 四川成都 610000）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe.）为姜科多年生草本植物，又称生姜、黄姜等，我国中部、东南部至西南部各省区广为栽培，亚洲热带地区亦常见栽培。生姜是药用、食用、加工等多用途经济作物，是我国重要的外贸产品，具有市场需求大、产量高、经济效益好等特点，中国是世界上生姜栽培面积最大且生产总量最多的国家[1-4]。生姜一般不开花，很难进行有性繁殖，生产上主要进行无性繁殖。无性繁殖的生姜容易受到多种病毒的侵染，造成品种严重退化、产量下降、种质资源变劣，一般减产30%～50%，严重制约了生姜的生产发展[5]。云南地方生姜品种是当地重要经济作物，主要靠农户自己留种种植，多年种植后种性退化严重，生姜产量和品质受到很大影响，亟需快繁技术进行品种提纯复壮。国内外目前尚无高抗病毒的生姜品种和高效杀灭病毒药剂，因此采用茎尖组织培养脱毒生姜苗，成为防治病毒提高生姜产量和品质的首选方法[6]。本研究利用热处理和茎尖脱毒相结合的方法进行催芽钝化病毒、表面消毒、茎尖分生组织剥取，对无菌苗诱导培养（基本培养基为 MS附加不同比例的激素）、继代诱导培养、生根诱导等一系列实验操作及培养基配方进行优化，旨在建立文山地方品种生姜快繁体系，为姜种的快速繁殖提供技术保障，同时为其生产应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为文山地方生姜品种小黄姜，2018年9月收获，2019年2月份芽点萌发，待用。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗诱导培养

1.2.1 .1 选材及热处理选取优良单株作茎尖剥离材料，采用热处理结合茎尖脱毒技术。放置在光照培养箱中以长光照高温热处理（16 h光照，38～41℃；8 h 黑暗，30～32℃）一周。

1.2.1 .2 诱导培养基的制备MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂 7 g/L+蔗糖30 g/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+琼脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L，熬制好后分装入瓶。在 0.12 Mpa/cm2压力下灭菌20～ 23 min，冷却备用。

1.2.1 .3 茎尖剥离接种将生姜 2～3 cm 的嫩芽放入纱布袋，加 1～2滴洗洁精，用自来水冲洗 1 h后，倒掉水，置于超净工作台中，在75%酒精中浸泡 20～30 s，再用 2%次氯酸钠溶液消毒 12～18 min；取出用无菌水冲洗 3～5次，用灭菌滤纸吸干材料表面水分，在体视解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶，切取带2～4个叶原基（1.0 mm左右）的生长点，放入装有培养基的培养瓶中，每瓶放1个生长点并注明品种、茎尖号、接种日期。培养条件：置于培养箱中进行诱导培养，日温 21～25℃，夜温15～18℃，光照时数 l2～14 h/d，光照强度 2 000～3 000 1x。

1.2.2 继代培养待诱导出芽后，在超净工作台中用剪刀将生姜小芽（不带叶片）切下来接种到继代培养基中，培养基配方：MS+6-BA 0.5 mg/L+琼脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L；MS+琼脂 7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L。培养条件同1.2.1。

1.2.3 生根培养待诱导出芽后，在超净工作台中用剪刀将生姜小芽（不带叶片）切下来接种到生根培养基中，培养基配方：1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+卡拉胶7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+卡拉胶7 g/L+蔗糖30 g/L；1/2 MS+卡拉胶7 g/L+蔗糖30 g/L。培养条件同1.2.1。

1.2.4 驯化移栽基质配方：蛭石∶珍珠岩=1∶1（m∶m，下同）（CK）；蛭石∶椰糠=2∶1；蛭石∶椰糠=1∶1；椰糠；营养土；营养土∶椰糠=1∶1。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方式对茎尖的影响

从表1可以看出，最佳消毒方法是75%酒精20 s+2%次氯酸钠15 min，这种消毒方法污染率仅为5%，未污染的茎尖颜色正常，没有出现坏死现象。酒精的消毒时间过长容易导致外植体边缘褐化变色，次氯酸钠消毒时间过程容易导致外植体出现坏死现象，培养一段时间后茎尖死亡。因此，合适的消毒方式不仅要考虑污染率，还要看后期的生长状况。

2.2 不同培养基对茎尖诱导的影响

从表2可以看出，在培养基1中，茎尖长势弱，生长缓慢，芽分蘖慢；培养基2中，茎尖长势较快，芽分蘖侧芽速度快；培养基3中，前期长势较快，但是长了很多根毛，后期长势缓慢。可能是生姜对 6-BA浓度敏感度低，较高浓度有利于茎尖分蘖，但对 NAA浓度非常敏感，容易长根毛[7-8]。诱导生长40 d的茎尖见图1。

图1 诱导生长40 d的茎尖

表2 不同培养基对茎尖诱导的影响

2.3 不同培养基对继代培养的影响

使用3种不同配方培养基进行继代培养，结果（表3）发现，培养基 2的增殖系数较高，达到 5，并且组培苗长势正常，这可能是由于生姜本身内源激素充足，足够组培苗生长，不需要单独添加外源激素。培养基 3增殖系数仅为 3，组培苗长势比较弱，生长缓慢。培养基1增殖系数最高，达到了 7，但是发出的芽非常弱小，后期部分死亡。

表3 不同培养基对继代培养的影响

2.4 不同培养基对生根培养的影响

从表4可以看出，培养基1的生根率为100%，根系3～5根，根系粗短，为较适宜的生根培养基；培养基2生根率100%，但是根系多，根系细长；培养基3生根率80%，根系多，细小，容易折断。生根阶段使用卡拉胶，移栽时根部培养基易清洗，减少根部损伤，增加移栽成活率。培养基1生长情况见图2。

图2 培养基1生姜生长情况

表4 不同培养基对生根培养的影响

2.5 不同材料配制栽培基质对生姜种姜繁育的影响

基质栽培是用自身不含营养成分的珍珠岩、蛭石、河沙等代替土壤作为基质，高密度栽植试管苗，在部分或全部人工控制温、光、水、肥及生长调节剂等条件下，快速繁育种姜获得下代姜种[9-10]。本试验将资源丰富的营养土（属于优质低位泥炭土）、椰糠（椰子外壳纤维粉末）运用到生姜种姜的生产中，试验效果良好。以小黄姜为材料，经栽培基质配制试验可知，在相同栽培条件和管理措施下，不同材料配制栽培基质中，最优栽培基质为“营养土∶椰糠=1∶1”（表5），比传统对照采用“蛭石+珍珠岩=2∶1”的基质，产量提高50%，经济效益明显增加。处理6生姜移栽生长情况见图3。

表5 不同材料配制栽培基质对生姜种姜繁育的影响

图3 处理6生姜移栽生长情况

3 讨论与结论

姜种的快速繁殖可提供技术保障，为生产应用提供支撑。生姜有许多个品种，在具体的组培快繁中应根据生姜品种选择合适的培养基、激素配比及培养条件，以完善生姜的组培快繁技术。根据文献报道，6-BA能促进生姜愈伤组织诱导与分化，但不同生姜品种在组织培养中对6-BA和NAA的浓度配比要求不同，这可能与生姜不同品种的基因型和培养条件等因素有关。过高的NAA 浓度也会抑制生姜幼苗不定芽的形成，适宜的较低浓度的 NAA能和 6-BA起到协同增益的作用，既能促进生姜幼苗不定芽的发生，又能促进生姜组培苗生长[5,11]。葛胜娟[12]研究认为，添加6-BA和NAA的培养基更能促进生姜幼芽的分化和增殖。本实验表明，在诱导阶段，NAA浓度同为0.1 mg/L时，6-BA浓度为1.0 mg/L时，诱导效果最好；NAA浓度增加到 0.5 mg/L，诱导效果降低。吕金丽等[13]的研究结果也表明，当 6-BA浓度相同，NAA浓度过大时，会抑制愈伤的形成。此外，本实验表明，最佳继代培养基为MS+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，当加入6-BA后，发出的芽非常弱小，后期部分死亡，这与吕金丽等[13]和王少铭等[14]研究得出的最佳继代培养基都加入了 6-BA和 NAA的结果不一致，这可能是地域及地方品种的不一致所造成的差异。本研究结果可为云南文山当地生姜优良种苗的快速繁殖提供技术支撑，同时为文山种质资源保存、组培扩繁、品种改良、育种等研究奠定基础，促进文山州及周边地区生姜产业持续健康发展。