儋州鸡鸡冠形态差异与BMP2、CHADL蛋白表达关联性分析

2022-05-18曹婷姬孟瑶施力光荀文娟杨德智侯冠彧

热带农业科学 2022年4期

曹婷姬孟瑶,2 施力光荀文娟,2 杨德智侯冠彧

（1.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南海口 571101；2.海南大学动物科技学院海南海口 570228；3 内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古呼和浩特 010018）

儋州鸡属于小型土鸡品种，是肉用型地方优良品种，又称儋州小种鸡、儋州小种肉鸡和儋州北岸小种鸡，在儋州市各乡镇皆有养殖。因其肉质鲜嫩，肉香浓郁，屠体皮肤薄，蛋白含量高，肌内脂肪、皮下脂肪含量低等优势，深受广大消费者的喜爱[1-2]。

鸡冠是鸡头部的皮肤衍生物，起源于喙的上方[3-4]。鸡冠是优质肉鸡的一项重要包装性状，是消费者选购禽肉产品的重要参考因素[5-7]。鸡冠发育与鸡的生长发育有密切关联，遗传力也较高[8-9]。因此，鸡冠的发育已经成为优质肉鸡选育的重要目标性状之一。鸡中最为常见的冠型为单冠，就遗传学研究而言，单冠是野生型性状，其余则为突变性状[10-12]。突变的鸡冠性状包括玫瑰冠、豆冠、胡桃冠、双冠、三叉冠、多冠和无冠，其中不同突变型内又分为若干表型。

鸡冠的形态差异受多因子控制。BMP2(Bone morphogenetic protein 2，骨形态发生蛋白) 基因和CHADL(Chondroadherin-like protein，软骨蛋白样蛋白)基因都是被转录组测序技术鉴定为参与鸡冠发育的候选基因[13-15]。BMP2和CHADL这2个基因位于鸡冠QTL上[16]。其中BMP2属于转化生长因子超家族中的一员，它能影响骨的生理机能（繁殖力）和增加骨沉积，刺激成骨细胞增殖和分化，刺激骨的形成，被认为是活性最强的唯一能单独诱导成骨的因子[17]。关于鸡BMP2和CHADL基因的研究甚少，尚不确定其在鸡冠发育和分化过程中起到的具体调控作用，可以作为调节鸡冠发育的候选基因重点研究，为探索鸡冠发育调节机理提供试验基础。

为了进一步探索BMP2和CHADL基因在儋州鸡鸡冠发育过程中发挥的作用，采用免疫印迹（Western Blot）试验方法，对儋州鸡保种选育基地儋州鸡主要鸡冠形态（单冠和玫瑰冠）、不同月龄（2月龄至青年期，4月龄至性成熟启动期，6月龄至性成熟完全期）、不同性别等的鸡冠组织进行BMP2、CHADL蛋白水平的表达测定和关联性分析；并对性成熟中期（5月龄）儋州鸡公鸡、母鸡不同冠型进行以上 2个蛋白的表达比较分析。为揭示鸡冠发育调控机制和分子选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材儋州鸡群体均由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所儋州鸡选育基地提供，出壳后在相同的营养水平和管理条件下养殖，待到鸡冠长到可分辨形态类型时按照单冠组和玫瑰冠冠组群进行筛选分群，挑选健康单冠、玫瑰冠组群各 150只（公母比例 4∶1），继续同条件养殖，准备在2、4、5、6月龄时分别进行鸡冠组织样本采集。

1.1.2 主要试剂仪器一抗：BMP2（博奥森bs-10696R）、CHADL（博奥森 bs-13885R）、β-Actin（博士德 BM0627），二抗：HRP-羊抗兔 IgG+HRP-羊抗小鼠IgG，博士德BA1056，RIPA裂解液，抗体稀释液，蛋白抑制剂，PBS，电泳液，PVDF膜等。

匀浆机，电泳仪，培养箱，玻璃皿等。

1.2 方法

1.2.1 试验动物样本采集待试验鸡生长到2月龄（青年期）、4月龄（性成熟启动期）、6月龄（性成熟完全期）时，屠宰并快速采集儋州鸡公鸡单冠和玫瑰冠鸡冠组织（各5只样本重复）；并在5月龄时（性成熟中期）屠宰并快速采集各5只儋州鸡公鸡单冠和玫瑰冠、儋州鸡母鸡单冠和玫瑰冠鸡冠中间部分组织。存放于-80℃备用。

1.2.2 Western blotting检测蛋白表达采用免疫印迹（Western Blot）试验方法，对2月龄（青年期）、4月龄（性成熟启动期）、6月龄（性成熟完全期）儋州鸡公鸡单冠和玫瑰冠组织进行BMP2、CHADL蛋白表达分析实验；并对性成熟中期（5月龄）儋州鸡公鸡、母鸡单冠、玫瑰冠组织进行BMP2、CHADL蛋白表达分析实验。具体操作如下：

蛋白样品制备（40 mg左右冷冻鸡冠组织样品匀浆提取蛋白质，含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液作为匀浆介质）→蛋白定量（使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，并用PBS将每组蛋白稀释定量，确保每组的蛋白浓度在同一水平）→上样电泳（将变性后的蛋白以 50 μg总蛋白的上样量进行SDS-PAGE凝胶电泳）→转膜（电泳结束后转移至PVDF膜上）→封闭（在室温下用封闭缓冲液封闭膜 1 h，然后将膜在TBST中洗涤3次）→一抗孵育（与一抗孵育1.5 h或过夜）→二抗孵育（TBST洗涤 3次并与二抗孵育1小时）→显影曝光（在膜上均匀滴上ECL发光液—Biosharp，用发光图像分析仪 Champ Chemi系统拍摄照片）。

1.2.3 数据统计及分析灰度值分析：通过Image J软件进行量化分析（目的蛋白灰度值/内参灰度值），SAS软件统计分析，p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同冠型、月龄儋州鸡公鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL基因蛋白水平表达分析

蛋白水平表达分析结果显示：儋州鸡公鸡的单冠和玫瑰冠组织中BMP2蛋白表达水平在2、4、6月龄的表达趋势均为由高到低再到高，且在 4到6月龄均差异显著（p＜0.05，下同）；而CHADL蛋白表达水平呈上升趋势，但差异不显著（p＞0.05，下同）；2月龄公鸡单冠组中BMP2蛋白表达水平低于玫瑰冠，差异不显著；4、6月龄公鸡单冠组织中 BMP2蛋白表达水平高于玫瑰冠，差异也不显著；2、6月龄公鸡单冠组织中CHADL蛋白表达水平低于玫瑰冠，而 4月龄公鸡单冠组织中 CHADL蛋白表达水平高于玫瑰冠，差异均不显著。表达分析结果见图1和图2。

图1 不同冠型、月龄儋州鸡公鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL基因蛋白水平表达（WB显色）

图2 不同冠型、月龄儋州鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL蛋白表达统计分析结果（灰度值）

2.2 性成熟中期不同冠型、性别儋州鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL基因蛋白水平表达分析

蛋白水平表达分析结果显示：性成熟中期（5月龄）儋州鸡公鸡和母鸡单冠组织中 BMP2、CHADL蛋白表达水平均高于其在玫瑰冠组，且BMP2蛋白在公鸡2冠型组织间的表达差异显著，2种蛋白表达在母鸡 2冠型组织间差异不显著；性成熟中期玫瑰冠型鸡冠组织中公鸡的BMP2蛋白表达水平均显著低于母鸡，不同性别和冠型鸡冠组织中的CHADL蛋白表达水平差异不显著表达分析结果见图3和图4。

图3 性成熟中期（5月龄）不同冠型、性别儋州鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL基因蛋白水平表达（WB显色）

图4 性成熟中期（5月龄）不同冠型、性别儋州鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL蛋白表达统计分析结果（灰度值）

3 讨论与结论

3.1 讨论

鸡冠是鸡的第二性征中最重要、最明显的特征，其发育是成长和性成熟程度的参考指标，也是决定销售等级和价格的关键因素[18]。所以，鸡冠的类型和发育一直是养殖产业和鸡群繁殖育种关注的重点，鸡冠的发育和筛选也已成为优质肉鸡选育的重要目标性状之一[8,19]。但仍有很多因素制约着鸡冠性状的选育进展，如世代间隔较长等问题。从分子水平对复杂性状的遗传机制进行解析，寻找关键的分子标记用于辅助选择，已经成为提高动物育种进展的重要方法之一。鸡冠的形态差异受多因子控制，但目前在分子水平进行鸡冠性状的研究较少。

BMP2和CHADL基因是参与骨骼和软骨组织合成的作用基因，也是近年来被转录组测序技术鉴定为参与鸡冠发育的候选基因[13-15]。其中有学者通过QTL定位发现BMP2可共同参与鸡冠发育调控作用[20]；也有研究证实，BMP2基因通过钙质分配参与鸡冠发育过程[21]；近期有研究发现，BMP2基因在鸡冠发育中起到负调控作用[14]；同时也有相关研究人员研究得出，CHADL基因可能在鸡冠发育过程中起到正调控作用，可以促进鸡冠发育[15]；近期有研究表明，CHADL基因也可能通过调控鸡冠真皮层胶原纤维的合成作用来参与鸡冠发育[14]。

由于BMP2和CHADL基因被挖掘为调控鸡冠发育的候选基因较晚，且相关机制研究甚少，尚不确定其在鸡冠发育和分化过程中起到的具体作用。近期，王琨等[13]对不同周龄公鸡鸡冠组织中BMP2、CHADL基因的表达进行分析，结果表明：BMP2基因的表达量呈现先升高后降低的趋势，在13周龄时表达量最高(p＜0.05)；而CHADL基因的表达量随着鸡冠发育逐渐升高(p＜0.05)。并得出BMP2和CHADL分别在鸡冠发育过程中发挥了抑制/促进鸡冠发育的作用的结论[14]。本文通过对不同月龄的儋州鸡公鸡不同冠型中这2种基因蛋白水平的表达进行研究发现，儋州鸡公鸡的单冠和玫瑰冠组织中BMP2的蛋白表达在2、4、6月龄的表达趋势均为由高到低再到高，而 4月龄正是肉鸡的性成熟启动期，该阶段的雄性第二性征主要性状——鸡冠的发育可能是一个高峰阶段，这个高峰阶段的BMP2蛋白表达却最低；且性成熟中期的鸡冠大小排序为公鸡玫瑰冠＞公鸡单冠＞母鸡单冠，这也与 BMP2的表达量呈负相关，所以BMP2的蛋白水平的表达也可能对鸡冠的发育、大小和冠型起到一定的抑制作用；从本研究结果还可以看出，BMP2的蛋白水平表达在性成熟中期公鸡的单冠和玫瑰冠差异较显著，说明BMP2蛋白对儋州鸡公鸡的冠型和性成熟中期的调控作用较大；而CHADL蛋白的表达量虽然在儋州鸡公鸡不同月龄和不同冠型的鸡冠组织中表达差异不显著，但呈一定的上升趋势，这与前期王琨等[14]对该基因的表达趋势一致，但是由于CHADL蛋白水平的表达差异并不显著，所以本试验不能确定CHADL的蛋白表达是否对鸡冠的表型和生长发育存在调控关联作用，还需要进一步研究探索。