热量限制抑制内质网应激对脑缺血再灌注损伤的影响

张玉东，刘恒方，张敏，王成名，田建荣

（郑州大学第五附属医院 神经内三科，河南 郑州 450000）

在中国，缺血性脑卒中的发病率正在以每年8.7%的速度增长，其高死亡率及高致残率给患者和社会带来沉重的负担［1］。目前研究发现，缺血性卒中发生后采用早期溶栓治疗或是通过介入促使血管再通，会进一步引起脑组织损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）［2-3］。因此，避免CIRI成为临床中急需解决的问题。生理状态下，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是细胞自我保护机制，能够维持细胞内环境稳态，而CIRI引起的剧烈刺激使内质网内大量错误折叠蛋白堆积以及发生未折叠蛋白质反应（unfolded protein response，URR），导致细胞凋亡［4-5］。国外最新研究表明热量限制（calorie restriction，CR）对大脑健康和认知功能起保护作用［6］，保护缺血半暗带，减少脑梗死面积，促进脑缺血后的神经功能恢复［7］。目前，国内关于CR是否能通过抑制ERS通路保护脑组织的研究较少，本实验通过对小鼠提前CR干预，进一步建立脑缺血再灌注模型，并检测相关蛋白表达，分析是否CR通过抑制小鼠ERS通路对CIRI后脑组织的损伤起保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择SPF级6～8周雄性健康C57BL／6J小鼠30只，采用随机数表法将其分成假手术组（Sham组）、热量限制组（CR组）及造模组（CIRI组），每组10只。根据国外文献［8］，CR组给予小鼠日常所需热量的60%～80%，自由进水，持续干预4周，其余组小鼠自由进食、饮水。本实验动物由郑州市兴华实验动物养殖场提供，许可证编号：SCXK（豫）2019-0002。本研究经郑州大学实验动物管理委员会批准。并遵循美国《实验动物管理和使用指南》。

1.2 质量与血糖小鼠持续干预至28 d后，限制其摄食与饮水，并于次日早上8：00测其质量。并于同一天早上8：30采取剪尾法测其空腹血糖。

1.3 主要实验试剂苏木精-伊红（hematoxylineosin staining，HE）染色试剂盒购自赛诺特生物技术有限公司，大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）线栓购自北京西农科技发展有限公司，聚偏 二 氟 乙 烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（0.45μm）购自Merck公司，RIPA裂解液、脱脂奶粉及彩虹180光谱蛋白Marker购自北京索莱宝公司，四甲基乙二胺（TEMED）购自北京雷根生物技术有限公司，葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78 kD，GRP78）、C／EBP同源蛋白（C／EBP-homologous protein，CHOP）及caspase-3购自武汉三鹰生物技术有限公司，山羊抗兔二抗购自华安生物技术有限公司。

1.4 主要器械电泳、转膜器购自美国Bio-Rad公司；超低温冰箱购自青岛海尔股份有限公司，全自动包埋机购自Leica公司，显微镜购自北京中西远大科技有限公司，多功能离心机购自Eppendorf公司，血糖测量仪购自北京怡成生物电子技术股份有限公司。

1.5 模型制作与评分用40 g·L-1的水合氯醛麻醉小鼠，备皮，消毒，沿正中切口切开颈部皮肤，分离组织，暴露右侧颈动脉，注意避开迷走神经，采取Longa线栓法闭塞小鼠右侧大脑中动脉，缝合，消毒，缺血1 h后拔出线栓，建立短暂性脑缺血再灌注模型（tMCAO），将小鼠置入恒温箱中，待小鼠清醒。再灌注24 h后，对小鼠采用改良的Garcia JH评分，评分越低代表神经功能缺损越严重［9］。

1.6 HE染色及免疫组化缺血再灌注24 h后，灌注小鼠，直至清亮无色液体流出后，取出完整脑组织，固定24 h，自动脱水机脱水，石蜡包埋，制作4μm的石蜡切片。分别进行HE染色及组织化学染色，染色完成后拍照。

1.7 蛋白质印迹法（1）裂解缺血再灌注24 h脑组织并得其蛋白；（2）离心30 min（4℃、14 000 r·min-1）；（3）取上层清液，变性（100℃，8 min），储存（-80℃）；（4）制胶；（5）上样；（6）电泳；（7）转至PVDF膜上；（8）封闭；（9）加入一抗，4℃孵育过夜；（10）TBST洗涤；（11）二抗60 min，室温孵育；（12）TBST洗涤；（13）曝光。用Image J软件分析结果，用GraphPad Prism 8.0作图。

1.8 统计学方法本实验数据采用SPSS 26.0统计软件分析。计量资料结果以均数±标准差（ˉx±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质量与血糖持续干预至28 d后，各组小鼠质量行单因素方差分析，结果显示，3组小鼠质量差异无统计学意义（P＞0.05）。对3组小鼠空腹血糖行单因素方差分析发现，3组小鼠空腹血糖不全相同，差异有统计学意义（P＜0.001），事后行组间两两比较显示，CR组与Sham组及CIRI组比较，差异有统计学意义（P＜0.001），其他两组差异无统计学意义（P=0.985）。见表1。

2.2 GarciaJH评分对小鼠造模后Garcia JH评分行单因素方差分析，3组小鼠造模后Garcia JH评分不全相等（P＜0.001）；与Sham组相比，CIRI组小鼠评分下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。CR组较CIRI组神经功能评分提高，较Sham组评分下降，差异有统计学意义（P＜0.001）。见表1。

表1 持续干预28 d后3组小鼠质量、空腹血糖及脑缺血再灌注后Garcia JH评分比较（ˉx±s）

2.3 HE染色不同小鼠海马CA1区HE染色可以看出，Sham组小鼠海马结构正常，细胞排列整齐；CIRI组海马CA1区可见细胞明显排列紊乱，细胞核深染，出现核固缩现象；CR组海马CA1区较CIRI组好转，但较Sham组排列依旧紊乱，形态异常，出现核固缩现象。3组小鼠大脑皮质HE染色，可以看出，Sham组小鼠大脑皮质结构保存完好，细胞数目较多；CIRI组较Sham组神经细胞数目明显减少，细胞核深染，核固缩；CR组较CIRI组小鼠大脑皮质细胞核深染、核固缩情况明显好转。见图1。

图1 再灌注24 h后小鼠脑海马CA1区及大脑皮质形态变化（HE染色，400×）

2.4 免疫组化小鼠免疫组化蛋白阳性颗粒呈棕黄色，与Sham组相比，余各组小鼠CHOP、GRP78蛋白表达均升高，CR组与CIRI组相比，CHOP、GRP78均降低（P＜0.05），Sham组相关蛋白仅微弱表达。见图2。

图2 缺血再灌注24 h后，各组小鼠CHOP及GRP78蛋白表达情况（400×）

2.5 蛋白质印迹法检测缺血再灌注24 h后缺血半暗带CHOP、GRP78以及caspase-3蛋白表达结果显示，与Sham组相比，CR组与CIRI组小鼠CHOP、GRP78以及caspase-3蛋白表达均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；CR组与CIRI组相比，CHOP、GRP78以及caspase-3蛋白表达降低（P＜0.05）。见图3。

图3 3组小鼠再灌注24 h后不同蛋白蛋白质印迹法检测结果

3 讨论

脑缺血再灌注后，缺血半暗带在钙超载、氧自由基以及能量耗竭等病理生理变化下出现内质网功能障碍导致UPR发生，持续剧烈的UPR会诱导神经元凋亡［4-5，10］。GRP78是分子伴侣，能减少蛋白质错误折叠和聚集并且加快蛋白质成熟，恢复蛋白质的正确构象［11］。GRP78仅在内质网表达，是ERS标志蛋白之一［12-13］。当细胞受到刺激时，细胞质内GRP78水平上升，维持细胞内蛋白正常构象，GRP78在ERS的发生发展过程中有重要意义［14］。发生剧烈ERS时，正常的细胞功能丧失，UPR通过肌醇需酶1α、蛋白激酶样ER激酶以及转录活化因子6这3种途径使CHOP活化并且大量表达［15］，CHOP激活其下游凋亡相关基因，使BCL-2／Bax失衡并大量表达凋亡蛋白caspase-3，最终使细胞发生凋亡，CHOP也是ERS的标志蛋白之一［16-17］。

CR是指在保证生物个体不发生营养不良的前提下，通过限制食物热量的摄入，使机体能量消耗量大于摄入量［18-19］。通过基础研究发现，CR提前干预可以抑制血管内膜斑块形成［20］，稳定血压［21］，降低血糖及血脂等相关危险因素［22-23］。研究发现，CR可以降低脑卒中发病率，降低脑卒中后的病死率，减轻小鼠脑卒中后缺血半暗带的氧化损伤，降低缺血部位炎症因子水平，减少脑梗死面积，保护神经元，促进卒中后认知功能恢复以及保护大脑［7，24-25］。然而，目前缺乏关于CR是否通过抑制ERS减少再灌注损伤的研究。

本实验CR持续干预至结束时，CR组与CIRI组、Sham组比较，质量差异无统计学意义，干预后CR组空腹血糖水平下降，并且稳定，差异有统计学意义，说明CR在不影响质量增长的情况下，降低空腹血糖，减少脑梗死发病的危险因素，与国外研究结果［26］一致。Garcia JH评分提示CIRI组缺血再灌注24 h后神经功能缺损严重，差异有统计学意义，CR组与CIRI组相比，神经功能缺损评分提高，说明通过CR提前干预，可以改善小鼠卒中后神经功能障碍，本实验结果与国外研究结果［27］一致。本实验小鼠海马CA1区与大脑皮质HE染色显示，Sham组小鼠海马CA1区与大脑皮质结构正常，细胞排列整齐，细胞数目较多存活；CIRI组海马CA1区与大脑皮质可见明显结构排列紊乱，细胞大量死亡，细胞核深染并出现核固缩现象；CR组较CIRI组海马CA1区及大脑皮质情况好转，但较Sham组排列依旧紊乱，形态异常，出现核固缩现象，这说明CR提前干预能够保护脑梗死后神经元。用免疫组化及蛋白质印迹法检测ERS相关蛋白发现，Sham组微弱表达，说明生理状态下ERS相关蛋白几乎不表达或仅仅微弱表达；CIRI组蛋白大量表达，说明脑缺血再灌注的剧烈刺激使ERS通路激活，细胞凋亡蛋白caspase-3大量表达，进一步将引发细胞凋亡；CR组蛋白较CIRI组表达下降，差异有统计学意义，说明通过CR干预下调ERS通路的相关蛋白，从而发挥保护作用。

综上所述，CR持续干预控制脑梗死发病相关危险因素，脑血流再通后减轻再灌注损伤，下调ERS通路相关凋亡蛋白表达发挥保护神经元作用，改善神经功能。国外研究指出，CR控制血糖、血脂、血压等危险因素，降低心脑血管疾病以及慢性病的发病率，提高居民生存质量，缓解目前医疗资源紧张的情况［19］。目前，我国很少将CR作为治疗手段应用于临床，可能与无法准确控制日常摄入量以及患者依从性差有关。我国关于CR临床研究仍有相当一部分空白，目前尚处于探索阶段。本实验为CR降低脑卒中血管再通后的CIRI提供实验依据。