华蟾素通过线粒体途径诱导鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的机制

蔡庆春，葛信艳，闫五玲，王白燕，李瑞琴，2b，王莹莹，曾小虎，吕欢欢

（1.河南中医药大学第三附属医院 病理科，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学a.医学院；b.中医药科学院，河南 郑州 450046）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常见恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，约1.2／10万［1］。由于早期症状不典型，70%以上的鼻咽癌患者就诊时已经是中晚期，治疗效果较差，如何延长中晚期患者的生存期，一直是全世界学者研究的重点［2］。在2018年新发的129 079例鼻咽癌病例及72 987例相关死亡病例中，大多数位于东南亚和中国南部，中国华南地区的发病率格外高，大约是北方地区的10倍，全球的20倍，并且每年呈上升趋势［3］。饮食习惯、生活方式和接触有害环境因素的差异可能是鼻咽癌发病率在地域上不同的根本原因，尤其是爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染与鼻咽癌发生密切相关［3-4］。90年代初，随着直线加速器和CT诊断的引进，鼻咽癌5 a生存率提高至60%；到了2000年，化疗的运用使鼻咽癌的生存率提高至70%；近10年来，新型的影像设备提高了肿瘤的检出率，精确的放射治疗也提高了疗效，5 a生存率可达到80%以上［5］。此外，鼻咽癌病理类型主要以中低分化鳞状细胞癌为主，且起病隐匿、恶性程度高、易发生转移［6］。早期以放疗为主，中晚期多为放疗联合化疗，但放疗、化疗副作用大，组织损害程度重［7］。因此，寻找副作用小、疗效可靠的药物是鼻咽癌研究的重要课题。

华蟾素是从传统中药蟾蜍皮中提取的水制剂，由蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的分泌物加工而成［8］。现代药理研究表明，蟾蜍类药物的有效成分如华蟾酥毒基、脂蟾毒基、蟾毒灵及蟾毒他灵等对多种肿瘤的生长具有良好的抑制活性［9］，其药理作用机制有抗肿瘤、抗病毒和免疫促进等［10］。通过检索近5年来文献发现，华蟾素在肺癌［11-12］、肝癌［13］、胃癌［14］、食管癌［15-16］、宫颈癌［17-18］、乳腺癌［19］等中晚期癌症中的应用越来越多，特别在临床应用及实验研究方面非常广泛，并且在治疗其他疾病（如乙肝［20］、银屑病［21］等）方面也都有涉及。但其对鼻咽癌细胞的影响报道较少，本研究采用体外实验研究华蟾素对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用，并探讨其抗鼻咽癌的作用及诱导鼻咽癌细胞凋亡的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料人鼻咽癌CNE-2细胞珠［中南大学高等研究中心（现代分析测试中心），批号：20170920］；华蟾素（安徽华润金蝉药业股份有限公司，批号：150723-1）；注射用顺铂（齐鲁制药有限公司，国药准字H37021357）；RPMI-1640培养液（北京索莱宝科技公司，批号：20180410）；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、DMSO、吖啶橙／溴化乙锭（acridine orange／ethidium bromide，AO／EB）双染试剂盒（北京索莱宝科技 公 司，批 号 分 别 为：1117X052、20180113、20180413）；Annexin V-FITC／PI试剂盒（美国BD公司，批号：20180521）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）兔抗人单克隆抗体、兔抗细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）（武汉三鹰生物技术有限公司，批号分别为：20180823、20180921）；二氧化碳（carbon dioxide，CO2）恒温培养箱（美国Thermo公司，型号：DYCZ-404111）；倒置荧光显微镜（日本OLYMPUS公司，型号：IX73）；酶标仪（美国BIO-RAD公司，型号：iMark）；流式细胞仪（美国BIO-RAD公司，型号：BD Accuri C6 flow cytometer）；半干转仪（美国BIORAD公司，型号：Trans-Blot Turbo System）；自动凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司，型号：ChemiDoc）。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将人鼻咽癌细胞CNE-2用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于5%体积分数CO2、37℃培养箱中培养，然后行常规复苏、冻存、传代、培养。取培养至对数生长期、细胞状态良好且稳定的细胞用于后续实验。

1.2.2MTT实验检测细胞增殖抑制率 取对数生长期细胞，以细胞水平为4×104mL-1单细胞悬液接种于96孔板中培养，待细胞贴壁生长状态良好时，吸出培养液，每孔加入不同剂量药物200μL，阳性对照组加入2 mg·L-1的顺铂，阴性对照组加入与实验组同等体积的培养液，实验组加入华蟾素0.25、0.5、1、2、4 g·L-1的稀释液，各组设6个复孔，分别培养24、48、72 h后每孔加入5 g·L-1MTT溶液20μL继续培养4～6 h，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，置于振荡器10 min摇匀，酶标仪以490 nm波长处重复测量3次所得光密度（optical density，OD）值，计算增殖抑制率，公式如下：

式中R为增殖抑制率（%），D1为实验组OD值，D2为对照组OD值。

1.2.3细胞生长状态观察 由上述MTT实验检测得出华蟾素（2 g·L-1）对细胞增殖抑制率与阳性顺铂对照组结果相近，故以华蟾素（1、2 g·L-1）定为实验组剂量。取对数生长期细胞，随机分为4组：阴性对照组（等体积的培养液）、阳性对照组（顺铂2 mg·L-1）、华蟾素（1 g·L-1）低剂量组、华蟾素（2 g·L-1）高剂量组。倒置显微镜下观察各组细胞在不同时间点的形态变化。

1.2.4AO／EB双荧光染色法观察CNE-2细胞凋亡情况 取对数生长期的鼻咽癌CNE-2细胞，胰酶消化，调整细胞水平为2×106mL-1，接种于6孔板中，培养24 h后，实验组加入华蟾素1、2 g·L-1的稀释液，阳性对照组加入2 mg·L-1的顺铂，阴性对照组仅加入与实验组同等体积的培养液，继续培养24、48 h后弃上清液，加入胰酶消化，低速离心收集细胞，用PBS洗涤，1 500 r·min-1，离心5 min，用50μL PBS重悬细胞，加入工作液（AO、EB溶液按1∶1等体积）1μL，混匀，吸取10μL滴加于载玻片上，倒置荧光显微镜下观察细胞颜色及形态，区分活细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率 取生长状态良好的细胞，胰酶消化，离心，用完全培养液制成细胞悬液，调整细胞水平为2×106mL-1，接种于6孔板中，置于培养箱中培养；24 h后弃上清液，分别加入用完全培养液配好的华蟾素稀释液及阳性、阴性对照药，各实验组作用CNE-2细胞24、48 h后收集并洗涤细胞，加入Binding Buffer液500μL重悬细胞，避光加入Annexin V-FITC 5μL、PI 5μL，室温孵育15 min，采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测。其中被PI染色的为坏死细胞（散落在左上象限），只能被Annexin V-FITC染色的为早期凋亡细胞（散落在右下象限），能同时被Annexin V-FITC和PI染色的为晚期凋亡细胞（散落在右上象限），不能被染色的为正常细胞（散落在左下象限），总凋亡率为早期凋亡率与晚期凋亡率相加所得之和。

1.2.6免疫印迹法（Western blot）检测细胞内凋亡相关蛋白 将阴性对照组、阳性对照组及华蟾素各实验

组分别作用于CNE-2细胞24、48 h后，收集细胞并提取各组细胞总蛋白，行蛋白定量、电泳、转膜、封闭、孵育抗体（一抗按1∶1 000稀释，二抗按按1∶5 000稀释）及曝光，后检测线粒体凋亡通路相关蛋白（Cyt-C、caspase-9）的相对表达量。

1.2.7统计学方法 统计分析采用GraphPad Prism 8.0统计软件。计量资料以均数±标准差（ˉx±s）表示，多组间比较采用双因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测华蟾素对CNE-2细胞增殖抑制作用的影响华蟾素作用于CNE-2细胞后，在相同时间段，随着药物水平的升高，细胞增殖抑制率升高；当剂量一定时，随着药物所用时间延长，细胞增殖抑制率也升高。作用24、48 h后，各华蟾素组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组比较，华蟾素2 g·L-1组对CNE-2细胞增殖抑制作用与阳性对照组作用相近，华蟾素0.25、0.5、1 g·L-1抑制率均低于阳性对照组（P＜0.05），华蟾素4 g·L-1组抑制率高于阳性对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 华蟾素对CNE-2细胞增殖抑制率的影响（ˉx±s，%）

2.2 华蟾素对CNE-2细胞生长状态的影响根据MTT实验结果，选取华蟾素1、2 g·L-1组作为实验组，加药24 h后倒置显微镜下观察细胞生长状态，阴性对照组细胞生长状态良好，细胞密集，胞质均匀透亮，颗粒均匀；与阴性对照组相比，阳性对照组、华蟾素不同水平组均有不同程度的细胞死亡；与阳性对照组相比，华蟾素2 g·L-1组细胞生长明显变慢、萎缩、崩解、死亡、脱落，细胞形态变化越大，死亡脱落的细胞越多（见图1）。

图1 倒置显微镜下各组CNE-2细胞形态（200×）

2.3 倒置荧光显微镜下AO／EB荧光染色后细胞形态观察华蟾素1、2 g·L-1组作用于CNE-2细胞24、48 h后，用AO／EB荧光染色，倒置荧光显微镜下观察，阴性对照组细胞核大小一致，核染色质分布均匀呈绿色，细胞形态正常，为活细胞。与阴性对照组相比，阳性对照组及华蟾素各组作用24 h后，镜下除了有绿色荧光的活细胞，还可看到细胞核呈固缩状、月牙形的橘红色荧光，部分细胞核可观察到凋亡小体，此种细胞为凋亡细胞；还可见胞质为绿色、胞核为不规则橘红色或核形态异常的早期凋亡细胞；也见染成红色且形态正常的坏死细胞。与阳性对照组相比较，随着华蟾素药物水平的升高，凋亡细胞数量也增多，华蟾素组48 h凋亡细胞数量多于24 h，且有时间、浓度依赖性（见图2）。

图2 AO／EB染色后荧光显微镜下观察（200×）

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率华蟾素作用于CNE-2细胞24、48 h后，各华蟾素组凋亡率均高于阴性对照组；而与阴性对照组相比，从24 h到48 h华蟾素1 g·L-1的细胞凋亡率从（7.27±0.42）%增至（17.10±0.75）%，华蟾素2 g·L-1的细胞凋亡率从（11.87±1.33）%增至（19.80±1.64）%，表明随着华蟾素药物水平升高、作用时间延长，细胞凋亡率也不断升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；48 h华蟾素2 g·L-1组凋亡率与阳性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示诱导凋亡作用与阳性对照组相近，可见华蟾素2 g·L-1组诱导CNE-2细胞凋亡效果相当于顺铂（见图3、4）。

图3 华蟾素对CNE-2细胞24 h及48 h凋亡率的影响

图4 华蟾素对CNE-2细胞凋亡率的影响柱状图

2.5 Westernblot检测相关蛋白Cyt-C、caspase-9的表达华蟾素作用于CNE-2细胞24、48 h后，Western blot检测线粒体凋亡途径相关蛋白Cyt-C、caspase-9的表达，结果显示：与阴性对照组相比，华蟾素各组Cyt-C、caspase-9的表达量均增加（P＜0.05），且随着药物水平的升高及作用时间的延长，Cyt-C、caspase-9的表达量均增加，华蟾素2 g·L-1组与阳性对照组表达量接近（见图5、6）。

图5 华蟾素作用CNE-2细胞24 h后对Cyt-C、caspase-9蛋白表达的影响

图6 华蟾素作用CNE-2细胞48 h后对Cyt-C、caspase-9蛋白表达的影响

3 讨论

鼻咽癌由于发病位置特殊，手术不易切除，同步放化疗是鼻咽癌的主要治疗方法之一［4］。尽管放化疗有令人满意的生存率，但放化疗预后较差、常伴有并发症及其耐药性成为治愈复发性鼻咽癌患者的一大障碍［3-4］。近年来，中医中药的运用受到多数人的青睐，临床上常采用放化疗联合中医药综合治疗来减轻放化疗的毒副作用，提高肿瘤病灶的控制率，以改善患者生活质量［22］。

研究显示，蟾蜍等中药制剂能减轻鼻咽癌放化疗的急性反应，与放化疗药物联合应用可提高肿瘤病灶的控制率。雷金华等［23］报道，95例接受放射治疗的鼻咽癌患者同时口服华蟾素胶囊，放疗副作用明显减轻，生存质量提高。此外，放疗联合静脉滴注华蟾素，能有效提高鼻咽癌肿瘤的消退率，缓解原发病灶，减少淋巴结转移灶的残留，并能减轻放疗中的口腔黏膜反应，减轻疼痛等［24-25］。实验研究显示，蟾蜍中的有效成分华蟾酥毒基可通过激活氯通道诱导鼻咽癌细胞凋亡［26］。上述结果表明，蟾蜍及其有效成分（如华蟾素）在鼻咽癌治疗中已有初步研究，且临床上将其应用到放化疗的辅助治疗中取得了明显效果，但其治疗肿瘤的作用机制仍不清楚。

引起细胞凋亡的途径主要有内源性线粒体途径、外源性死亡受体途径及内质网应激途径。Cyt-C是线粒体凋亡通路的起始蛋白，在介导线粒体凋亡中起着重要作用［27-28］。Cyt-C的活化主要是由于线粒体接收到外界凋亡信号后，引起线粒体膜电位的改变，以致线粒体肿胀，其形态和功能发生变化，导致通透性增加，随后Cyt-C从线粒体内游离移行至胞质，在胞质中与caspase-9结合，引起下游caspase家族的级联反应，从而诱导细胞凋亡［29-30］。

从本研究来看，运用MTT法检测华蟾素对鼻咽癌CNE-2细胞活力百分率，与阳性对照组相比，华蟾素2 g·L-1及4 g·L-1组能抑制鼻咽癌CNE-2细胞的增殖；与阳性对照组相比，华蟾素2 g·L-1组细胞出现生长明显变慢、萎缩、崩解、死亡及脱落的现象；运用AO／EB荧光染色，发现随着华蟾素药物水平的升高，凋亡细胞数量也增多，主要表现为细胞核呈固缩状、月牙形的橘红色荧光，部分细胞核可观察到有凋亡小体的凋亡细胞，还可见胞质为绿色、胞核为不规则橘红色或核形态异常的早期凋亡细胞。此外，与阴性对照组相比，从24 h到48 h华蟾素1 g·L-1组的细胞凋亡率从（7.27±0.42）%增至（17.10±0.75）%，华蟾素2 g·L-1组的细胞凋亡率从（11.87±1.33）%增至（19.80±1.64）%，表明随着华蟾素药物水平升高、作用时间延长，细胞凋亡率也在不断升高。已有研究显示，凋亡相关蛋白Cyt-C、caspase-9在线粒体凋亡途径中具有高表达的特点，而在其他通路中无这种特点［31］。验证华蟾素对CNE-2细胞凋亡相关Cyt-C、caspase-9蛋白的影响时发现，华蟾素1、2 g·L-1作用细胞24、48 h后能明显上调Cyt-C、caspase-9蛋白的表达，其作用机制可能与通过激活线粒体通路，上调凋亡相关蛋白Cyt-C、caspase-9，激活caspase家族的级联反应，导致线粒体功能受损，进而促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡有关。

综上，华蟾素可能通过内源性线粒体途径来诱导鼻咽癌细胞凋亡，但其在外源性死亡受体途径及内质网应激途径上还需要进一步研究。此外，由于华蟾素与鼻咽癌的相关研究还较少，为了探讨更为详细的机制，最好能进一步进行华蟾素相关的体内实验，为直接阐明华蟾素抗肿瘤作用和药效价值提供新依据。本文为华蟾素抗鼻咽癌的应用奠定了一定的基础，更多的机制还需要进一步探讨。