河南地区汉族人群的载脂蛋白E基因多态性分析

肖瑞霞，张 珂，修贺明

（河南金泰生物技术股份有限公司，河南 郑州 450000）

载脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因位于第19号染色体长臂13区2带，含有4个外显子和3个内含子，分子量为34KDa，由299个氨基酸组成[1]。APOE有3种不同的等位基因，编码3种不同的蛋白质亚型E2、E3、E4，并通过氨基酸序列第112和158位第四外显子中C/T核苷酸的变化进行区分，当精氨酸或半胱氨酸发生变化时，E2亚型在112和158处存在半胱氨酸残基；E3亚型在112处存在半胱氨酸，在158处存在精氨酸；E4亚型在2个位置存在精氨酸[2]。APOE基因可产生6种基因型，E2/E2、E3/E3、E4/E4 3种纯合子型和E2/E3、E2/E4、E3/E4 3种杂合子型[3]。APOE基因编码的载脂蛋白E是多种脂蛋白的一部分，如乳糜蛋白、极低密度蛋白、低密度蛋白和高密度蛋白，在脂质运输和代谢调节中具有重要意义，是影响血脂水平的重要内在因素[4]。载脂蛋白E的合成主要在肝脏中进行，也存在于肾脏、肠道、大脑、巨噬细胞、性腺和脾脏等其他组织中[5]。据报道，在神经系统，主要是大脑中，星形胶质细胞合成和分泌这种载脂蛋白，在中枢神经系统和神经元的脂质运转中起着重要作用[6]。针对不同人群的研究表明，APOE基因多态性参与血脂水平的变化，是动脉粥样硬化早期及发展过程中个体差异的主要原因，也是老年痴呆（AD）、冠心病、脑梗死等疾病的易感候选基因[7-8]。在人群中E3亚型最常见，它的功能和特征与人类的寿命有关；E2亚型具有保护作用，不利于乳糜蛋白的代谢，参与低密度脂蛋白的代谢，与Ⅲ型高脂血症的发生有关；E4亚型是血浆胆固醇差异的主要决定因素，也是心脑血管相关疾病的遗传危险因素[9-11]。本研究通过对河南地区汉族人群的APOE基因多态性进行分析，最终实现心脑血管疾病的早发现、早治疗，以达到降低心脑血管疾病的发病率或延缓发病的目的。

1 材料与方法

1.1 材料 柱式口腔拭子基因组DNA抽提试剂盒（上海生工），无水乙醇（天津市天力化学），恒温金属浴（杭州米欧），超微量蛋白核酸浓度分析仪（Biodrop），高速离心机（上海力申），低温冰箱（海尔），PCR扩增仪（ABI），10 SpectroCHIP® CPM-96 Arrays试剂盒（Agena），纯净水（本实验室自制），引物由上海生工合成，静音混合器，DNA质谱仪（Agena MassARRA 系统）。

1.2 分析方法

1.2.1 研究对象 根据知情同意的原则，采用口腔拭子采集河南地区汉族受检人群的口腔黏膜细胞，抽提DNA进行遗传检测，共获取有效样本量363例，其中男性188例，女性175例。

1.2.2 DNA提取 取100 μL的口腔黏膜细胞悬液，采用上海生工的DNA提取试剂盒提取基因组DNA，DNA采用紫外分光光度计进行测定，浓度大于2 ng/μL均可进行后续实验。

1.2.3 PCR引物设计及扩增 根据NCBI发表的人的APOE基因标准序列，应用AgenaCX在线软件针对rs429358和rs7412 2个突变位点设计引物，引物序列见表1。扩增体系分3步，PCR反应体系：ddH2O 0.8 μL，含有 20 mmol/L MgCl2的 10×PCR Buffer 0.5 μL，25 mmol/L MgCl20.4 μL，25 mmol/L dNTP Mix 0.1 μL，5 U/μL PCR 酶0.2 μL，PCR-F、PCR-R 引物各 0.5 μL，模板 DNA 2 μL；SAP反应：ddH2O 1.53 μL，SAP Buffer 0.17 μL，SAP 酶 0.3 μL；iPLEX 延伸反应：ddH2O 0.619 μL，iPLEX Buffer 0.2 μL，iPLEX Termination mix 0.2 μL，iPLEX 酶 0.041 μL，EXT-F、EXT-R延伸引物混液0.94 μL，总体积为9 μL。PCR反应程序，PCR反应程序：95℃预变性2 min，45个循环（95 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72℃延伸 5 min；SAP反应：37 ℃ 40 min，85℃ 5 min，4 ℃ 2 min；iPLEX 反应：94 ℃ 30 s，40 个循环（94 ℃ 5 s，5 个循环（52 ℃ 5 s，80 ℃5 s）），2 ℃ 5 min。

表1 APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T PCR和iPLEX引物序列

1.2.4 分析基因型 按照相关操作流程，使用飞行时间质谱（MALDI-TOF）检测。将密封保存备用的PCR扩增产物通过点样仪转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测。由于分子量不同，同一个SNP的等位基因形成不同的检测峰得出各自的基因分型。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS20.0软件对数据进行分析。用χ2检验基因型频率和等位基因频率的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，当P＞0.05时，认为基因型频率和等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡，当P＜0.05时，各基因型的实际值和理论值之间的差异有统计学意义，认为基因型频率和等位基因频率分布不符合Hardy-Weinberg平衡。

2 结果

2.1 APOE基因型分型结果 经检验APOE 2个SNP位点rs429358和rs7412在河南汉族人群中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），说明本研究所选择的样本具有群体代表性。SNP分型结果表明，河南汉族人群APOE基因rs429358 T/C位点存在TT、TC、CC基因型，其频率分别为87.05%、12.40%和0.55%；T和C等位基因频率分别为93.25%和6.75%。而rs7412 C/T位点存在CC、CT和TT基因型，基因频率分别为83.20%、14.88%和1.92%；C和T等位基因频率分别为90.63%和9.37%。DNA分型结果见图1。在河南汉族人群中，APOE基因rs429358T/C和rs7412 C/T位点的基因型和等位基因频率在不同性别间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图1 河南汉族人群APOE基因rs429358T/C和rs7412 C/T飞行时间质谱结果图

表2 APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T多态性在河南汉族不同性别人群中的比较 [ 例(%)]

2.2 APOE基因多态性分布 APOE基因上的两个SNP位点rs429358和rs7412可产生3种不同的基因亚型APOE2、APOE3、APOE4和 6种不同的表型 E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4、E3/E4，每种基因型在河南人群中的分布频率见表3。APOE不同的基因型与发生心脑血管疾病、老年痴呆等风险不同，服用他汀类药物的疗效也不同，最终将6种不同的表型分为3大类，APOE保护基因型（E2/E2，E2/E3），APOE 常见基因型（E3/E3，E2/E4）和APOE危险基因型（E3/E4，E4/E4），在河南汉族人群中这3种类型占比分别为15.15%，73.55%和11.29%。这3种类型组合在不同性别间的比较，差异无统计学意义（χ2=8.850，P＞0.05），本次研究纳入的样本具有群体代表性。

表3 APOE6种基因型在河南汉族人群中的分布频率 [ 例(%)]

2.3 河南地区APOE等位基因分型频数和频率与其他地区比较 地区APOE基因rs429358T/C和rs7412C/T多态性分型频率的分布情况与潮汕[12]、北京[13]比较，差异有统计学意义（χ2=9.151、P=0.010，χ2=10.137、P=0.006）；其分布情况与梅州[14]、武汉[15]、江西[16]、重庆[17]比较，差异无统计学意义（χ2=4.241、P=0.120，χ2=5.521、P=0.063，χ2=0.623、P=0.732，χ2=0.091、P=0.955），见表 4。

表4 不同地区APOE等位基因分型频数和频率比较[ 例(%)]

3 讨论

心脑血管疾病是最常见的死亡和致残原因之一。由于我国人口老龄化加剧，高脂血症的患病率也不断提高，心脑血管疾病负担预计将进一步增加。许多研究表明，心脑血管疾病的病因较复杂，包括遗传和环境因素[18]。

载脂蛋白E主要运输脂蛋白，APOE基因的突变可以引起血脂的异常。脂代谢异常是导致心脑血管疾病的重要危险因素之一，研究表明APOE基因与老年痴呆等疾病密切相关，同时其具有免疫调节、促进神经再生的作用[19]。APOE 2个SNP位点rs429358和rs7412基因的多态性可以影响机体的脂代谢、他汀类药物的疗效，是心脑血管疾病的候选基因[20]。他汀类药物能够增加肝细胞表面的低密度脂蛋白受体的数量和活性来达到降脂的目的，正常人群中E3/E3分型最多，他汀类药物疗效较好。APOE4基因型所表达的E4蛋白与肝细胞表面的低密度脂蛋白受体亲和力低，明显增加了心脑血管疾病的风险，他汀类药物对这种基因型的患者往往疗效不佳或者无效[21]。本研究对河南地区汉族人群中APOE基因多态性的分布进行了研究，结果表明在APOE 6种基因型种E3/E3最为常见，分布频率达到71.9%，高于文献报道中的60%；E2/E4分布频率为1.65%，略低于文献报道的2.00%[25]。E3等位基因被认为是世界上大多数人群中的野生等位基因，参与脂质稳态，在代谢中起着关键作用，在一个群体中E3等位基因的频率高，影响血脂状况的疾病风险就会降低[22]。本研究中各种人群E2等位基因的频率较低，E2/E2为1.93%，高于报道的1%；E2/E3分布频率为13.22%，高于报道的13.00%[25]；E2等位基因对低密度脂蛋白降低起保护作用，它编码的载脂蛋白不易与肝脏受体结合，影响与代谢性疾病相关的乳糜微粒的代谢[23]；E4等位基因被认为是心脑血管疾病发生的遗传危险因素，可作为高脂血症和心脑血管疾病预防计划的初步筛选指标，在河南汉族人群中E3/E4分布频率为10.74%，低于报道的22.00%，E4/E4为0.55%，低于报道的2.00%[24-25]。从上述研究结果可以看出，河南地区汉族人群E4分型低于国内其他报道的水平；与我国其他地区人群的APOE基因3种分型的频率比较发现，河南人群的3种分型的频率与重庆人群的基因频率最为接近，与潮汕人群的差异较大，梅州和北京地区的E4基因型占比较高；对APOE基因多态性进行检测，可以明确基因分型，对携带E4基因的患者进行用药指导，干预饮食、生活习惯等，最终达到心脑血管疾病的早发现、早治疗、延缓发病的目的。

MALDI-TOF是近年发展起来检测核酸的强有力工具，它的原理就是利用激光激发样本，使样本与基质之间发生电荷的转移，样本在电场的作用下，由于分子量不同，产生不同的荷之比，在飞行管道内到达检测器的飞行时间不同，以此鉴别出不同的碱基。由于该技术具有准确率高、耗时短，在基因多态性的分型中应用越来越广泛，在诊断检测中具有一定的优势。