宁夏地区羊源大肠埃希氏菌的分离鉴定及耐药性检测

冯 杰，马剑钢，张 新，刘晨阳，杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院，杨陵 712100)

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli)是动物肠道共栖菌和条件性致病菌，可引起多种动物的大肠埃希氏菌病，尤其是幼龄动物多发[1-2]。近年来，随着养羊业的不断发展，我国羊的养殖量不断增加，疾病的发生率也随之不断增长，特别是羊腹泻病的发生，而引起羊腹泻病主要病原菌之一为大肠埃希氏菌。大肠埃希氏菌引起的羊腹泻病多见于羔羊，病死率高达50%，对养羊业造成了极大损失[3-4]。羊腹泻病在国内外均长期存在，已成为影响养羊业的世界性疾病，其严重性已经对养羊业的发展造成了不可忽视的威胁。

在羊养殖的过程中，越来越多的抗菌药物被用于治疗临床疾病或作为饲料添加剂，造成羊源大肠埃希氏菌耐药菌株不断增多，耐药机制也日渐复杂，给羊疾病的防治带来了严峻挑战[5]。有文献报道，动物源耐药菌和耐药基因可通过食物链、质粒、转座子、整合子、噬菌体、插入序列共同区等传递给人类，危害人类健康[6-9]。

目前，我国尚未报道对宁夏地区羊源大肠埃希氏菌耐药性的研究，羊源大肠埃希氏菌的临床用药缺乏理论参考[10]。本研究旨在通过开展宁夏地区羊源性大肠埃希氏菌的分离鉴定与耐药性检测，阐明该地区羊源性大肠埃希氏菌的耐药现状，为养羊业的临床合理用药、预防和治疗羊腹泻病提供依据，同时对于监测宁夏地区羊源性细菌的耐药性也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2018年4月17日至2018年4月29日，在宁夏某两个屠宰场采集动物脏器及肠道拭子108份。

1.1.2 菌株 标准菌株大肠埃希氏菌ATCC25922由西北农林科技大学动物医院院兽医传染病学实验室保存。

1.1.3 主要试剂 普通营养琼脂、肉汤、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂(EMB)、大肠埃希氏菌科生化鉴定管、甲基红指示剂、VP指示剂、吲哚指示剂，杭州天和微生物试剂有限公司产品；含有氨苄西林(AM)、阿莫西林/克拉维酸(A/C)、头孢他啶(CTD)、头孢噻呋(CFT)、美罗培南(IPM)、庆大霉素(GM)、大观霉素(SPT)、四环素(TE)、氟苯尼考(FFC)、黏菌素(COL)、磺胺异噁唑(SF)、复方新诺明(SXT)、氧氟沙星(OFX)、恩诺沙星(ENR)、乙酰甲喹(MEQ)、安普霉素(AP)16种抗菌标准药品的耐药性监测板，天津金章科技发展有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 高压灭菌箱(YXQ-50SⅡ)，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司产品；冰箱2℃～4℃和-20℃(BCD-315NGS)，青岛海尔股份有限公司产品；电子天平感量0.1g(CP124C)，奥豪斯仪器有限公司产品；生物安全柜(SW-CJ-1C)，苏州安泰空气净化技术有限公司产品；超纯水机(Advanced-IV-08)，艾柯水处理设备有限公司产品；微量加样器(10 μL、100 μL、1000 μL和八道排枪)，艾本德中国有限公司产品；恒温水浴锅(CF1524R)，上海世泽生物科技有限公司产品；恒温振荡器(HZP-250)，上海精宏实验设备有限公司产品；高速低温离心机(Micro17R)，赛默飞世尔科技公司产品；PCR仪(C1000)，安诺伦(北京)生物科技有限公司产品；核酸电泳仪(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统(Syngene GeneGenius)，北京百晶生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 羊源大肠埃希氏菌分离与纯化

1.2.1.1 菌株初步分离 将采集样品无菌接种于普通平皿，37℃培养24 h，记录菌落生长特征，挑取单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察菌体形态。

1.2.1.2 菌株分离培养 将初步分离的可疑菌落接种于麦康凯琼脂培养基，37℃恒温培养24 h，观察菌落生长状况，记录菌落生长特征，挑取单菌落，革兰氏染色、镜检，观察记录菌体形态。

1.2.1.3 菌株的纯化培养 挑取上述分离培养得到的红色单菌落接种于伊红美蓝培养基上，37℃恒温培养24 h，观察结果，再挑取带有金属光泽的菌落进行纯化培养，接种于肉汤中，在37℃恒温培养24 h，保菌备用。

1.2.2 羊源大肠埃希氏菌鉴定 将保存的疑似菌株的菌液接种于普通琼脂培养基上，37℃恒温培养24 h，分别挑取单个菌落接种于微量生化管内进行生化鉴定，结果判定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》。

1.2.3 羊源大肠埃希氏菌药敏试验 通过微量肉汤稀释法测定大肠埃希氏菌对选用抗生素的最小抑菌浓度(MIC)，在细菌用96孔板每孔加入50 μL CAHMB，并将氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢他啶、头孢噻呋、美罗培南、庆大霉素、大观霉素、安普霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异噁唑、复方新诺明、恩诺沙星、氧氟沙星、乙酰甲喹、黏菌素进行梯度稀释。血平板上刮取大肠埃希氏菌菌落，生理盐水稀释为麦氏浊度为0.5的菌液。每60 μL菌液与5 mL药敏接种培养液混合均匀后，按照每孔50 μL加入96孔细菌培养板，置于厌氧培养箱37 ℃培养24 h。通过观察96孔细菌培养板内大肠埃希氏菌生长情况统计试验菌株对所选抗生素的MIC值并根据CLSI抗微生物药物敏感性试验判断标准判断试验菌株对所选抗生素耐药性。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定结果

2.1.1 细菌分离结果 革兰氏染色镜检，其中有略深染、两端钝圆的革兰氏阴性杆状菌。对采集的样品进行培养，在麦康凯琼脂培养基上形成粉红色、边缘光滑整齐、湿润的圆型菌落；在伊红美蓝培养基上长出带金属光泽、深紫黑色的圆形菌落；在普通琼脂斜面上的菌落为灰白色; 在普通肉汤中可见管底有灰白色沉淀，肉汤浑浊，并有不愉快气味。与大肠埃希氏菌的培养特性一致，共分离出58株，分离率达53.70%。

2.2 生化试验结果

58株分离菌均对葡萄糖、乳糖、麦芽糖，不分解蔗糖，甲基红(MR) 试验阳性，乙酰甲基甲醇(VP) 试验、硫化氢试验、枸橼酸盐试验均为阴性，结果判定为大肠埃希氏菌，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》中大肠埃希氏菌的生化特性，结果吻合。

2.3 药敏试验结果

2.3.1 细菌的耐药性 58株大肠埃希氏菌对16种临床常用抗菌药物的耐药情况见表2。由表2可知，分离菌株对除对安普霉素完全不耐药以外，对其他15种抗菌药物均具有不同程度的耐药性。其中对氟苯尼考、四环素、复方新诺明、磺胺异噁唑耐药率最高，耐药率均达到28%；其次，对恩诺沙星、庆大霉素、黏菌素也有耐药性。

2.3.2 细菌的多重耐药性 58株羊源大肠埃希氏菌对16种抗菌药物的多重耐药现象见表3。由表3可知，出现耐药的菌株数共34株，占总菌数的58.62%，有15株大肠埃希氏菌对1种药物存在耐药性，耐药率为44.12%，有3株大肠埃希氏菌对2种药物存在耐药性，耐药率为8.82%，有16株大肠埃希氏菌对3种或3种以上的药物存在耐药性，耐药率为47.05%。

2.3.3 羊源大肠埃希氏菌的耐药谱型 58株羊源大肠埃希氏菌的耐药谱型见表4。由表4可知，共有17种耐药类型，其中单重耐药、双重耐药的菌株有18株，其中主要的耐药类型为耐氟苯尼考，多重耐药的菌株主要耐庆大霉素、复方新诺明、四环素等。

3 讨论

本研究调查了宁夏地区羊源大肠埃希氏菌的耐药情况。从108份样品中分离出58株大肠埃希氏菌，分离率达53.7%，说明大肠埃希氏菌在宁夏羊群体中具有一定程度的流行。药敏试验结果表明，分离菌株中共有34株耐药株，耐药率达58.6%。有研究显示，中国东南地区的大肠埃希氏菌耐药率高于西北地区[11]。这种现象的产生可能与中国东南部地区抗生素的大量使用有关[12-13]。其中，对氟苯尼考、四环素、复方新诺明、磺胺异噁唑耐药率最高。氟苯尼考是氯霉素的一种氟化衍生物，1996年被批准用于治疗牛的呼吸道感染，之后被引入畜牧业。四环素的高耐药率在中国其他地区和国外也有记录。在我国，四环素被广泛用于治疗细菌性疾病和提高饲料转化效率[14-15]。大肠埃希氏菌对磺胺类药物的高度抗药性也曾在中国报道过[16-17]，因为磺胺类药物已经广泛和连续使用了80多年，早在1950年就已有耐药性的报道。其次，对恩诺沙星、庆大霉素、黏菌素也有耐药性。喹诺酮类药物耐药的主要机制是染色体编码，这是由于分子靶标(DNA旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ)的改变[18]。而大肠埃希氏菌对黏菌素的耐药性可能与携带耐药基因的质粒水平转移有关。58株大肠埃希氏菌均对安普霉素敏感。

表1 羊源大肠埃希氏菌对16种药的药敏试验结果

表2 羊源大肠埃希氏菌的多重耐药性

表3 羊源大肠埃希氏菌耐药谱型

本研究通过分析58株大肠埃希氏菌对16种抗菌药物的耐药谱得知，16株菌对至少3类抗菌药物都有耐药性，表现为多重耐药，其中五株菌对7种抗生素都有耐药性。表明宁夏羊源大肠埃希氏菌存在一定程度的多重耐药现象，这对临床上正确、合理地选用抗菌药物有一定参考意义。

临床上药物选择、用药剂量大多数情况下没有科学依据，部分养殖场在饲料和饮水中滥用抗生素，这些是导致很多细菌耐药的根本原因。因此，防止细菌的多重耐药，一方面要引导养殖户科学选药、合理用药，另一方面要严格把关饲料企业，禁止滥用抗生素作为饲料添加剂。另外，寻找抗生素的替代物，如一些中药提取物，加强动物自身抵抗病菌能力也不失为防止滥用抗生素的好对策。

本研究对从宁夏羊源样品中分离得到的58株大肠埃希氏菌进行了耐药性检测，通过分析其对16种抗菌药物的耐药谱得出，宁夏羊源大肠埃希氏菌存在一定程度的多重耐药现象，迫切需要科学指导和法律法规来限制和合理使用抗菌药物。