生物钟紊乱致心脏功能障碍的研究进展

梁 清，陈丽红

(大连医科大学 医学科学研究院， 辽宁 大连 116044)

1 生物钟及其分子生物学

昼夜节律(circadian rhythm)是一种以24 h为周期的生物节律，哺乳动物的众多生理功能和行为均具有昼夜节律，如睡眠-觉醒周期、体温、血压、心率等。昼夜节律受生物钟调控，生物钟可分为中央时钟和外周时钟，中央时钟由位于下丘脑视交叉上核的大约20 000个神经元组成，而外周时钟几乎存在于每个组织器官。光信号是主要的时钟输入信号，视网膜接受来自外界的光信号，将其传送到中央时钟，中央时钟又通过各种神经体液信号调节处于各个组织器官的外周时钟，使之与之同步，从而使整个机体的生物节律与外界光照环境保持同步[1]。除光照外，周期性进食、运动等也可以在一定程度上影响生物钟，尤其是外周时钟的运行，成为次要的同步化生物钟的信号。

在分子水平，哺乳动物的生物钟主要由一组时钟基因/蛋白组成的转录-翻译反馈回路来驱动。主要反馈调节通路由核心时钟基因/蛋白，包括Bmal1 (brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1)、Clock(circadian locomotor output cycles kaput)、Per1/2/3(period 1, 2，3)、Cry1/2(cryptochrome 1，2)、Ror(RAR-related orphan receptor)、Rev-erbα(NR1D1, nuclear receptor subfamily 1, group D, member 1)等组成(图1)。在24 h周期开始时，Bmal1和Clock蛋白形成异源二聚体，与Per和

图1 哺乳动物生物钟转录反馈调节通路Fig 1 Transcriptional feedback loops of the mammalian circadian clock

Cry基因启动子区域的E-box元件结合，激活其转录和翻译。Per和Cry蛋白在细胞质中积聚并转运到细胞核，抑制Bmal1-Clock异源二聚体的转录活性，从而抑制其自身的转录和翻译。整个过程形成一个周期约为24 h的反馈回路。Bmal1-Clock异源二聚体也能激活Ror和Rev-erbα，Ror和Rev-erb可以结合到Bmal1启动子区的Ror反应元件(Ror response element,RORE)，分别促进和抑制Bmal1的转录。此外，这些时钟基因还调控一些下游基因即钟控基因(clock controlled genes,CCGs)的表达，最终导致蛋白和细胞功能的振荡，进而调节多种生理和生命活动的昼夜节律。

2 光照和昼夜节律与心脏功能障碍

当哺乳动物的活动和行为与其周围环境光照的昼夜节律不同步时，会导致正常的心脏生理功能减退，同时可促进或加重心脏疾病的发生。如将正常小鼠的24 h光照周期改为22.5、27或者30 h均可导致其心率降低、节律改变，代谢率下降，心功能减退[2]。而对于患有扩张性心肌病的动物而言，给于每周1次的慢性昼夜颠倒，则可进一步显著缩短其生存时间[3]。小鼠行主动脉缩窄术诱导压力超负荷型心肌肥厚或行永久性冠脉结扎术诱导心肌梗死和心力衰竭后，将其置于光照周期为20 h的异常光照中，可显著恶化小鼠的心肌重构过程，其机制可能与促进炎性细胞浸润和增加细胞外基质沉积有关[4]，而当灯光恢复24 h正常光照周期时，恶化的心脏重构则可以得到一定程度的逆转。值得一提的是，正常光照周期时，单纯的压力超负荷并不影响时钟基因在心脏组织的表达，而当光照周期缩短至20 h，Bmal1和Per2的昼夜变化幅度则有所下降。因此，环境光照的昼夜节律改变可通过影响心脏组织核心生物钟基因的表达变化及节律异常，进而影响心脏功能，加速心脏疾病的发生发展。另有研究表明，采用左冠状动脉前降支结扎诱导小鼠发生急性心肌梗死后，将其置于全黑暗环境中仅仅5 d，即可通过改变机体的先天免疫反应过程，导致心脏重塑恶化，心肌梗死面积增大，提示短期的昼夜光照节律破坏亦可以对心脏功能造成显著影响。最后有研究者发现，对于节律周期只有22 h的仓鼠而言，若将其饲养在24 h光照周期环境中，则仓鼠容易发生广泛的心肌纤维化，进而影响心肌收缩能力。但有趣的是，当这类仓鼠被放置在与其生物钟周期匹配的光照周期(即22 h)条件下时，心脏结构和功能则可恢复正常，进一步证实了异常光照周期对心脏功能和疾病的不利影响[5]。

3 生物钟基因变异与心脏功能障碍

3.1 生物钟基因变异与心率失常

哺乳动物的心率具有明显的昼夜节律。Per3 5/5(Per3等位基因五重叠)患者的心率加快[6]。无论胚胎期(convditionalBmal1knockout, cKO)还是成年后(inducibleBmal1knockout, iKO)全身敲除Bmal1，小鼠心率的正常昼夜节律均完全丧失[7]；Clock点突变(cardiomyocyte-specificClockmutant, CCM)小鼠则心率节律减弱，振幅降低，提示核心时钟基因与心率的节律调节密不可分[8]。分子机制研究表明，cKO小鼠心率节律丧失可能跟K+电压门控通道蛋白Kcnd2(编码瞬时K+外流)的节律表达消失有关[9]，但在Bmal1心肌细胞特异性敲除(cardiomyocyte-specific Bmal1 knockout, CBK)小鼠中Kcnd2的节律表达却不受影响，提示Kcnd2的昼夜节律表达不受心脏外周生物钟的直接调控，而主要受神经体液因素调节。跟cKO和CBK小鼠不同，CCM小鼠在R-R间隔期出现明显的窦性心动过缓，其机制则主要与抑制了在心室传导中发挥重要作用的连接蛋白40在心脏中的昼夜节律表达有关[10]。此外，在血管组织中选择性敲除核受体PPARγ可也可通过影响Bmal1的转录和节律表达，进而减少小鼠心率的昼夜节律变化，进一步提示生物钟与心率昼夜节律调节的相关性。

3.2 生物钟基因变异与心肌梗死

临床和流行病学观察显示急性心肌梗死并非随机发生于全天任何时段,而是更多发生于清晨和上午时段,提示生物钟与心肌梗死密切相关。在ZT12(睡眠-觉醒过渡期)缺血的小鼠相比在ZT0(觉醒-睡眠过渡期)缺血的小鼠心脏梗死面积增加3.5倍，同时心肌纤维化恶化，心脏收缩功能减退，心力衰竭加重,而在Clock点突变(CCM)小鼠中，这种时间依赖性心脏缺血/再灌注反应则完全消失。进一步机制研究表明，心肌细胞内在生物钟可能通过调控Akt和GSK-3β激酶参与不同时间点心脏对缺血耐受的反应性调节[11]。此外，敲除核心生物钟基因Per2可通过抑制重要代谢调节因子Adora2b进而影响缺血心脏的糖酵解能力，增加心肌缺血/再灌注诱导的心肌梗死[12]。核心时钟基因Rev-erbɑ的激动剂(SR9009)则可通过抑制梗死后心脏组织炎性小体的激活，减少梗死范围的扩大[13]，并对心肌肥厚和心力衰竭也有一定的保护作用[14]。上述研究均提示，生物钟基因变异与心肌梗死的发生发展密切相关。

3.3 生物钟基因变异与扩张性心肌病

扩张性心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是心肌的原发性疾病，是充血性心力衰竭的主要原因之一，可导致发病率增加和过早死亡。内源性生物钟基因突变或缺失与DCM的发生发展密切相关，如Bmal1全身敲除小鼠(conditional knockout,cKO)，心肌细胞特异性Bmal1敲除(CBK)小鼠，及心肌细胞特异性Clock点突变(CCM)小鼠均容易发生年龄相关性扩心病[15]，表现为射血分数和短轴缩短分数下降，左心室扩张和心室壁变薄，心脏顺应性下降，并伴有炎性细胞浸润，细胞外基质增多[16]。有趣的是，雌性CCM小鼠则免受年龄相关心肌病的影响，提示雌激素可能对DCM有一定的保护作用[17]。机制研究表明，Bmal1可能通过调节Titin-cap蛋白(TCAP)调节心肌肌层的完整性，也可能通过调节线粒体自噬相关蛋白BNIP3从而调节线粒体功能[18]，进而直接或间接参与DCM的发生发展。此外，在对4周龄cKO小鼠心肌细胞大小的分析发现，其平均心肌细胞大小减少了19%,但心脏重量更重，表明可能伴随了明显的心肌细胞或其他细胞增生，由于心肌细胞增生主要发生在胚胎发育过程中和产后1周，提示Bmal1在调节心脏发育方面也可能起重要作用[19]。

3.4 生物钟基因变异与糖尿病心肌病

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症，可引起心脏微血管病变、心肌代谢紊乱和心肌纤维化，导致左心室肥厚、舒张期或收缩期功能障碍，最终发展为充血性心力衰竭，目前因糖尿病引发心肌损害而发生心力衰竭的比率接近30%。研究表明，无论是内源性还是外源性生物钟紊乱都可影响糖尿病及其并发症的发生发展。如Clock和Bmal1基因变异均可导致低胰岛素血症和Ⅱ型糖尿病，引起代谢异常表型，表现为糖异生受损、高瘦素血症、葡萄糖不耐受和血脂异常[20]。最近体外实验研究发现，过表达Bmal1可明显减弱高糖诱导的心肌细胞自噬抑制和心肌细胞损伤，而敲除Bmal1则使心肌细胞损伤加重。利用自噬稳定剂可以抑制Bmal1表达从而改变对心肌细胞存活的影响，提示Bmal1可通过调节细胞自噬，保护心肌细胞免受高糖毒性的影响[21]。在链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病模型中，心脏生物钟Bmal1、Cry1、Cry2节律蛋白则表达正常，相位提前约3 h[22]。然而，关于核心时钟基因在糖尿病心肌病中的直接作用目前尚未有明确的体内实验研究报道。

4 问题与展望

生物钟参与了人体众多生理功能和行为活动的调节。越来越多的证据表明，生物钟紊乱，如长期熬夜，会增加心脏疾病的患病风险。近年来，随着对各种生物钟紊乱模式动物及生物钟基因敲除或突变小鼠的广泛研究，关于生物钟紊乱对心脏生理功能调节及对疾病发生发展进程的影响已逐渐明晰。然而，目前的研究还主要停留在心脏表型分析的层面，其具体分子机制尚不完全清楚。如何发现新的生物钟分子靶点或从时间生物学角度为心脏疾病的治疗提供新策略尚有很大空间，也是心脏疾病防治的一个重要方向。已有临床研究表明，对于血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)等抗高血压药物，在恰当的时间选择恰当的给药方式(如临睡前顿服)，可显著提高降压效果并降低心脏危险事件的发生风险[23]。因此对于一些临床常用的心血管疾病防治药物，深入评价其最佳用药时间，将可望很大程度降低副作用、提升疗效。此外，心脏外科手术(如主动脉瓣置换术)时间的选择也可能与术后心肌梗死等不良时间的发生率有密切关系，下午手术组的主要不良心脏事件发生率可能明显低于上午组[24]。因此，更好的理解生物钟与心脏功能和疾病的关系有望为重大心血管疾病的治疗提供新思路。