血脑屏障体外细胞模型的建立与比较

苏钰雯，修建波，许 琪

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系 医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)

作为血液和中枢神经系统之间的动态复杂界面，血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)具有双重功能，即屏障和载体功能[1]，既能输送脑细胞正常代谢所必需的营养物质，又能阻隔许多有毒化合物和病原体，具有保护作用[2-3]。血脑屏障是一种选择性渗透屏障，大多数中枢神经系统候选药物在血脑屏障中的渗透性差，无法通过。基于细胞培养的体外BBB模型应运而生，利用原代细胞、永生化细胞系[4]或者干细胞[5]建立可靠的体外血脑屏障模型可以更准确地模拟体内屏障，这样的系统允许探索神经疾病恢复的新可能性。

星形胶质细胞包被中枢神经系统血管并赋予内皮细胞BBB特性[6]。周细胞与神经血管单位的各种成员相互作用，支持内皮细胞的萌发、分化和成熟来促进血脑屏障的发育[7]。本研究旨在探究星形胶质细胞和周细胞对血脑屏障结构和功能的影响，探究不同培养方式下血脑屏障细胞模型结构和功能的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3、人脑星形胶质母细胞瘤细胞系U87MG、人脑血管周细胞系HBVP(上海信裕公司)。

1.1.2 主要试剂：hCMEC/D3细胞专用培养基(XY-h070-0016)(上海信裕公司)；细胞培养用胎牛血清、DMEM培养基(16000-044、11995-065)(Gibco公司)；PBS、0.25%胰蛋白酶、青霉素链霉素(CC008、CC017、CC004)(Macgene公司)；10 kD 异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FD10S)(Sigma-Aldrich公司)；PECAM-1(CD31)抗体、Glut1 抗体、LRP-1抗体(ab76533、ab115730、ab92544)(Abcam公司)；PGP抗体(25081-1-AP)(Proteintech公司)； Trizol(15596018)(Invitrogen公司)；cDNA合成试剂盒(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 血脑屏障体外细胞模型的构建(图1)：对人脑微血管内皮细胞hCMEC/D3、人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87MG、人周细胞HBVP进行常规细胞培养。模型分为5组：1)单培养模型(仅培养hCMEC/D3)：在Transwell正面铺hCMEC/D3，在上室加入100 μL浓度为2×104个/mL的hCMEC/D3细胞悬液；2)双培养模型(hCMEC/D3与U87MG或HBVP双培养)：将Transwell装置翻转，铺HBVP或U87MG，用移液枪小心吸取50 μL浓度为5×104个/mL的HBVP细胞悬液或浓度为4×104个/mL的U87MG细胞悬液，培养12 h后正置Transwell，继续铺hCMEC/D3，在上室加入100 μL浓度为2×104个/mL的hCMEC/D3细胞悬液，在细胞培养箱中孵育培养；3)不接触共培养模型(hCMEC/D3与U87MG及HBVP均不接触)：在孔板底面铺HBVP，加入浓度为2.8×104个/mL的HBVP细胞悬液300 μL，12 h后继续加入浓度为2×104个/mL的U87MG细胞悬液300 μL，细胞培养箱中继续培养12 h，在Transwell上铺hCMEC/D3，在上室加入100 μL浓度为2×104个/mL的hCMEC/D3细胞悬液；4)半接触共培养模型(hCMEC/D3与HBVP通过Transwell膜接触，不接触U87MG)：Transwell装置翻转，铺HBVP，加入浓度为5×104个/mL的HBVP细胞悬液50 μL，12 h后在孔板底面铺U87MG，加入浓度为2×104个/mL的U87MG细胞悬液300 μL，培养12 h后正置Transwell，继续铺hCMEC/D3，在上室加入100 μL浓度为2×104个/mL的hCMEC/D3细胞悬液；5)全接触共培养模型(hCMEC/D3通过Transwell膜接触HBVP和U87MG)：Transwell装置翻转，铺HBVP，加入浓度为2.8×104个/mL的HBVP细胞悬液50 μL，12 h后继续铺U87MG，加入浓度为2×104个/mL的U87MG细细胞悬液50 μL， 培养12 h后正置Transwell，继续铺hCMEC/D3在上室加入100 μL浓度为2×104个/mL的hCMEC/D3细胞悬液。恒温细胞培养箱培养(37 ℃、5% CO2)。

Human microvascular endothelial cell(hCMEC/D3), Uppsala 87 malignant glioma (U87MG) cell and human pericyte(HBVP) were used to construct blood-brain barrier cell models; BEC.brain endothelial cell; A.schematic representation of the blood-brain barrier cell models; B-G.different types of models: B.only human microvascular endothelial cells; C.bi-cultures (U87+BEC); D.bi-cultures (HBVP+BEC); E.co-cultures(no-contact); F.co-cultures(semi-contact); G.co-cultures(full-contact)

1.2.2 渗透性检测：待细胞形成致密单层之后，对模型进行通透性检测实验。Transwell上室加入0.5 mg/mL的FITC-葡聚糖溶液(无血清、无酚红DMEM配制)0.1 mL，下室加入0.5 mg/mL的无FITC标记的葡聚糖溶液(无血清、无酚红DMEM配制)0.6 mL。置于细胞培养箱孵育1 h后分别从Transwell装置的上、下室提取样品，进行荧光分光光度计检测。计算细胞层的Pd值。Pd(cm/s)=(C/t)(1/A)×(V/L)(C是下室FITC-葡聚糖浓度，t是时间间隔，A是表面积，V是下室溶液体积，L是上室FITC-葡聚糖浓度)。因为葡萄糖浓度可用样品荧光强度表示，不同模型的t、A及V均相同，所以利用P=F1/F2(F1-上室样品荧光强度，F2-下室样品荧光强度)来表示各模型的通透性。检测未培养细胞的空白对照组Transwell的渗透性P0，以各模型P值与P0的比值来进行模型组间渗透性的比较。

1.2.3 紧密性检测：电阻仪EVOM2的STX2电极分别插入Transwell装置的上室和下室管腔侧。测量并记录细胞层的电阻值TEER。检测未培养细胞的空白对照组Transwell的紧密性T0，以各模型TEER值与T0的差值来进行模型组间紧密性的比较。

1.2.4 血脑屏障相关基因表达检测：胰蛋白酶消化细胞后收集细胞，使用Trizol法及氯仿分层法分离提取RNA。用cDNA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA后进行RT-qPCR检测(引物见表1)。结果以2-ΔΔCt进行相对定量计算。

表1 RT-qPCR检测引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.2.5 血脑屏障相关蛋白表达检测：胰蛋白酶消化细胞后收集细胞，制得蛋白样品。166 V恒压进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白， 240 mA恒流进行转膜，后利用相应的抗体进行孵育及处理后显影，检测血脑屏障相关蛋白的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同培养方式的血脑屏障(BBB)体外细胞模型的紧密性和通透性变化

半接触细胞共培养模型和全接触细胞共培养模型的紧密性比单培养和双培养以及不接触共培养模型的紧密性明显升高(P<0.01)；与半接触细胞共培养模型相比，全接触细胞共培养模型的紧密性更高(P<0.01)(图2A)。与单培养和双培养以及不接触共培养模型相比，半接触和全接触细胞共培养模型具有更低的渗透性(P<0.001)；且全接触细胞共培养模型的渗透性比半接触细胞共培养模型更低(P<0.05)(图2B)。

2.2 不同培养方式的血脑屏障(BBB)体外细胞模型的相关基因表达差异

BBB相关的结构基因PECAM-1，在全接触共培养模型中的表达最高(P<0.05)(图3A)。BBB相关的功能基因PGP和LRP-1在半接触共培养模型和全接触共培养模型中的表达水平升高(P<0.05)(图3B,C)。与其他培养模型相比，BBB相关功能基因GLUT1在全接触共培养模型中表现更高的水平(P<0.01)(图3D)。

2.3 不同培养方式的血脑屏障(BBB)体外细胞模型的相关蛋白表达

结构蛋白PECAM-1、功能蛋白GLUT1在全接触共培养模型中的表达水平升高(P<0.05)(图4A, C)。功能蛋白LRP-1在半接触共培养和全接触共培养模型中的表达水平升高(P<0.01)(图4B)。与单培养模型相比，双培养和共培养模型都表现出较高的BBB相关功能蛋白P-gp的表达(P<0.05)(图4D)。

3 讨论

血脑屏障在外周与中枢的物质传递和信息交流中具有重要作用，构建血脑屏障体外模型是研究血脑屏障的重要一环。血脑屏障的性质并不仅仅是内皮细胞自身的性质决定[8]，而是由大脑中的微环境决定的。胶质细胞和周细胞作为血脑屏障的重要组成部分，对血脑屏障的结构以及功能发挥有着重要的作用[7,9]。全接触共培养模型的紧密性最强，反映出周细胞和星形胶质细胞的确能够对血脑屏障的结构生成和功能发挥产生积极影响，而且星形胶质细胞和周细胞不与内皮细胞接触，仅释放某些影响因子在培养基中进而作用于内皮细胞，这种方式对于血脑屏障紧密性的影响并没有直接接触产生的影响更强。相较于其他模型，全接触共培养模型表现出最低的渗透性，即最强的物质屏障功能。对血脑屏障相关结构基因和蛋白PECAM-1的表达水平检测也印证了这一点。

TEER.trans-epithelial electrical resistance; T0.TEER of the transwell model without cell; P.permeability; P0.the permeability of the transwell model without cell; the permeability and tightness of the model were determined by the penetration rate of FITC-dextran and the TEER value; BEC.brain endothelial cell; A.TEER of different models；**P<0.01 compared with no-contact co-culture，#P<0.01 compared with semi-contact co-culture; B.permeability of different models; *P<0.05 compared with semi-contact co-culture, ***P<0.001 compared with no-contact co-culture

BEC.brain endothelial cell; A.PECAM-1 mRNA expression in different types of models, *P<0.05 compared with no-contact co-culture; B.P-gp mRNA expression in different types of models, *P<0.05 compared with no-contact co-culture; C.LRP-1 mRNA expression in different types of models, *P<0.05， **P<0.01 compared with no-contact co-culture; D.GLUT1 mRNA expression in different types of models, **P<0.01 compared with no-contact co-culture，#P<0.01 compared with semi-contact co-culture

BBB相关的基因和蛋白的表达在全接触模型中的表达都呈现高水平，证明星形胶质细胞和周细胞的存在及细胞之间的相互接触对血脑屏障的功能蛋白和基因的表达产生积极影响。但像P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)基因在半接触和全接触共培养模型中都有较高的表达，这可能是因为星形胶质细胞除了通过接触内皮细胞对BBB产生影响外，还可能通过释放因子在培养基中，继而影响BBB的形成，而这种间接作用对内皮细胞这些基因的表达影响比较大。综合来看，全接触共培养血脑屏障体外细胞模型的紧密性更强，渗透性更低，BBB相关的基因和蛋白的表达也水平也更高，是更接近血脑屏障生理状态的体外细胞模型。在接下来的研究中，可以利用这种体外模型探索某些营养物质的输送以及血脑屏障对某些有害物质的阻挡功能。

随着技术的不断发展，血脑屏障模型的建立也在不断地推陈出新。现在模型构建已经向微流控模型和3D模型方向以及干细胞方向[10]发展。总之，现有实验证明了血脑屏障体外模型作为人类相关疾病模型的多方面潜力，并有助于器官功能障碍的研究。建立可靠的体外血脑屏障模型可以极大地加快中枢神经系统药物的研发。

BEC.brain endothelial cell; A.PECAM-1 expression in different types of models, **P<0.01 compared with semi-contact co-culture, #P<0.001 compared with no-contact co-culture; B.LRP-1 expression in different types of models, #P<0.01 compared with no-contact co-culture; C.GLUT1 expression in different types of models, *P<0.05 compared with semi-contact co-culture; D.PGP expression in different types of models, △P<0.05 compared with BEC (only hCMEC/D3)