兔抗鼠MORF4L1 a多克隆抗体的制备与鉴定

李 芳，章 元，张 业*

(1.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系, 北京 100005； 2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 神经外科，北京 100730)

致死因子4样蛋白1(mortality factor 4-like protein 1,MORF4L1) 属于MORF家族[1], MORF4L1以其结构上独特的chromo结构域以及进化上高度保守性受到高度关注[2-3]。MORF4L1由于外显子跳跃型选择性剪接，产生两个变体a和b，变体a是在chromo结构域插入了40个氨基酸(图1)。在多个物种中均发现在chromo结构域插入选择性剪接外显子的MORF4L1变体，插入的氨基酸序列及插入位置具有多样性[4]。

研究发现，MORF4L1与Tip60/NuA4组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶(HDAC)相互作用，具有复杂的染色质重塑调控作用[6-9]。此外，MORF4L1还参与细胞周期调控、DNA损伤修复等细胞基础生理过程[10-15]。尽管大量研究对MORF4L1的功能进行了揭示，但对MORF4L1的长短变体在chromo结构的变异对其功能的影响却知之甚少。目前没有能够区分MORF4L1变体的商品化抗体，本研究根据小鼠MORF4L1 a、b变体的差异氨基酸序列合成多肽(图1)，经与载体蛋白偶联后免疫家兔，制备了多克隆抗体并进行纯化，制备的抗体能够特异性识别MORF4L1 a蛋白，为MORF4L1 的选择性剪接及其长变体的生物学意义的研究奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

pGEX-4T-2原核表达质粒和pCMV-3Tag-6真核表达质粒(本实验室保存)；新西兰大白兔(北京科宇动物养殖中心)；大肠杆菌Trans1T1、BL21菌株(北京全式金生物技术有限公司)；质粒提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；MORF4L1抗体(CST)；HRP标记的山羊抗兔IgG(北京博尔迈生物技术公司)；细胞核提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)；弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 多克隆抗体的制备：对NCBI Protein 提供的MORF4L1 a和MORF4L1 b的差异氨基酸序列进行抗原性分析后，选择MORF4L1 a的N端第52～66位的15个氨基酸作为抗原肽，与载体钥孔血蓝蛋白( keyhole limpet hemocyanin,KLH)进行偶联， 由上海生工有限公司完成。随后免疫两只新西兰大白兔，首次免疫使用抗原与弗氏完全佐剂等体积混合超声乳化，加强免疫使用抗原与弗氏不完全佐剂等体积超声乳化，背部皮下多点注射，共6次。在免疫后的第42～45天对动物进行终放血，终放血4 ℃放置1 d后，离心收集血清。

图1 小鼠MORF4L1蛋白a、b变体示意图Fig 1 Schematic diagram of mouse MORF4L1 isoform a and isoform b

1.2.2 多克隆抗体的纯化：将抗血清透析到除脂液(10 mmol/L NaCl，25 mmol/L冰醋酸，pH 5.2)中24 h; 随后离心，上清于PBS中进行4 ℃透析过夜。将多肽与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将抗血清与PBS等量混合后缓慢、多次上样，收集抗体，于PBS中进行4 ℃透析过夜。将抗体进行5%～15% SDS-PAGE后进行考马斯亮蓝染色，检测抗体纯度。

1.2.3 质粒的构建：利用实验室现有质粒作为模板扩增Morf4l1a，Morf4l1 b蛋白编码区，上游引物为：ATTAAGGATCCATGGCGCCCAAGCAGG(BamHⅠ)及下游引物为：TATATGTCGACCACGGCTTTCCGGT GG(SalⅠ)，原核表达质粒命名为pGEX-4T-2-M4L、pGEX-4T-2-M4S；真核表达质粒命名为pCMV-3Tag-6-M4L、pCMV-3Tag-6-M4S。引物由上海生工有限公司合成。设定PCR程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min,循环34次；72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收纯化，连接于载体，将连接产物转入大肠杆菌菌株Trans1t1，菌液涂板于LB平板37℃过夜培养；第2天挑取阳性菌落继续培养，提取质粒后进行BamHⅠ和SalⅠ酶切鉴定和DNA测序鉴定。

1.2.4 重组蛋白的原核表达与纯化：将质粒空载pGEX-4T-2和重组蛋白质粒pGEX-4T-2-M4S、pGEX-4T-2-M4L转化进入E.coliBL21，将菌液涂于LB平板，在37 ℃过夜培养；各质粒挑取阳性菌落接种于4 mL LB培养基中， 37 ℃ 180 r/min摇4 h至菌液呈薄雾状，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L继续诱导16 ℃ 20 h。离心收集菌体，弃上清，加入BC500缓冲液(20 mmol/L Tris, pH 7.4, 500 mmol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 10%甘油,0.5% Triton X-100)重悬菌体，将菌液进行超声破碎，程序设定为200 W，超声5 s,间隙15 s,超声至菌液相对澄清后，于4 ℃ 11 000 r/min 离心20 min，收集上清。准备glutathione-agarose 4B 珠子悬液，加入上清中于4 ℃孵育过夜。随后4 ℃ 800 ×g离心5 min，收集珠子，用BC500重复清洗2次，后换为BC100(20 mmol/L Tris, pH 7.4, 100 mmol/L NaCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 10%甘油, 0.2% NP40)清洗3次。取少量样品进行SDS-PAGE，分析GST-M4S、GST-M4L蛋白表达情况。

1.2.5 质粒的转染：将状态良好的人胚胎肾上皮细胞系HEK 293T接种于10 cm细胞皿中，在汇合度达到70%～90%时进行转染，转染前2 h更换新鲜培养基，吸取500 μL Opti-MEM稀释10 μg质粒，混匀后加入10 μL DNA Neofect转染试剂，混匀静置20 min。将静置后的混合液均匀滴加到细胞中并混匀,48 h后收取细胞。

1.2.6 Dot blot检测抗血清特异性：准备硝酸纤维素膜，将多肽用TBS溶解至0.1 μg/μL，取1 μL、2 μL点于膜上，自然风干。将膜置于5% BSA封闭液中室温封闭1 h。弃去封闭液，加入待检抗体(MORF4L1 a抗体稀释度为1∶5 000)室温振荡孵育30 min。TBST洗膜，每次5 min，重复3次。随后加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育30 min。TBST洗膜，每次5 min，重复3次。随后显影，分析实验结果。

1.2.7 ELISA检测抗体效价：PBST将多肽稀释至浓度为1 μg/mL，每孔100 μL,加入96孔酶标板于4 ℃包被过夜，5%BSA于室温封闭1 h，加入梯度浓度递减的抗体、阴性血清，每孔100 μL，室温静置1 h，加入碱性磷酸酶AP标记的羊抗兔IgG,室温孵育1 h，随后利用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物显色，滴加NaOH终止反应后，使用酶标仪检测各孔于405 nm处的吸光度值。

1.2.8 Western blot检测抗体特异性：取适量GST-M4S、GST-M4L重组蛋白和GST空白对照，经12%SDS-PAGE分离，以300 mA恒定电流转移到硝酸纤维素膜，5% BSA室温封闭1 h，TBST洗膜10 min；以本实验所得的抗体(1∶2 000稀释)和MORF4L1对照抗体(1∶2 000稀释)，4℃摇床孵育过夜；TBST洗膜，每次10 min，重复3次；加入羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)为二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜每次10 min，重复3次，ECL显影观察结果。收取瞬时表达FLAG-M4S、FLAG-M4L的HEK 293T细胞，经NE-PER试剂盒提取细胞核裂解液后，BCA法测定蛋白浓度后进行Western blot，程序如上。

2 结果

2.1 原核、真核表达质粒的鉴定

质粒经BamHⅠ和SalⅠ 双酶切，电泳后均可见991 bp、1 108 bp的重组目的片段(图2)，结果与预期结果相符。测序结果证实目的片段正确插入载体中，质粒构建成功。

2.2 GST-M4S、GST-M4L蛋白的原核表达和纯化

将GST融合蛋白进行原核诱导表达并纯化后进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色结果可见在62 ku、67 ku附近有高表达的蛋白条带，与预测的目的蛋白的大小相符合，蛋白纯度较高(图3)。根据BSA标准品的浓度估算蛋白浓度，GST-M4S浓度约为3.3 μg/μL，GST-M4L浓度约为2.5 μg/μL。

A: M.DNA marker， 1.pGEX-4T-2-M4S plasmid, 4.pGEX-4T-2-M4L, plasmid 2&5.pGEX-4T-2-M4S plasmid, pGEX-4T-2-M4L plasmid was digested by BamH Ⅰ enzyme, 3&6.pGEX-4T-2-M4S plasmid, pGEX-4T-2-M4L plasmid was digested by BamH Ⅰ and Sal Ⅰ enzyme; B:M.DNA marker, 1.pCMV-3Tag-6-M4S plasmid, 4.pCMV-3Tag-6-M4L plasmid, 2&5.pCMV-3Tag-6-M4S plasmid, pCMV-3Tag-6-M4L plasmid was digested by BamH Ⅰ enzyme, 3&6.pCMV-3Tag-6-M4S plasmid and pCMV-3Tag-6-M4L plasmid was digested by BamH Ⅰ and Sal Ⅰ enzyme

M.protein marker; 1-4.0.5 μg, 1 μg, 2 μg, 4 μg BSA; 5.purified GST protein; 6.purified GST-M4S recombinant protein; 7.purified GST-M4L recombi-nant protein图3 SDS-PAGE分析GST-M4S、GST-M4L融合蛋白的表达Fig 3 SDS-PAGE analysis of the expression of GST-M4S, GST-M4L recombination protein

2.3 抗MORF4L1 a多克隆抗体的鉴定

2.3.1 抗血清的特异性检测

结果显示1号家兔的抗血清能够特异地识别多肽，1号家兔抗血清特异性优于2号家兔，因此将1号家兔的抗血清进行纯化，用于后续实验。

2.3.2 抗体纯度检测

纯化后的抗体经5%～15%还原性梯度SDS-PAGE分析，纯度可达90%(图4)。

1.protein marker; 2.antibody after purification图4 SDS-PAGE分析抗体的纯度Fig 4 SDS-PAGE analyzed the purity of antibody after purification

2.3.3 抗体效价检测

通过间接ELISA实验检测抗体的效价，结果显示经过纯化后，抗体的效价大幅提高，可达1∶512 000，可用于后续实验(表1)。

2.3.4 抗体特异性检测

对抗体的特异性进行Western blot检测，结果显示，抗体能有效识别MORF4L1 a变体，具有良好的特异性(图5)。

表1 ELISA分析纯化后抗体效价Table 1 Titer of antibody detected by ELISA analysis

A:1.purified GST-M4S recombinant protein, 2.purified GST-M4L recombinant protein; B: 1.nuclear extracts of HEK 293T cells expressing FLAG-M4S, 2.nuclear extract of 293T cells expressing FLAG-M4L图5 Western blot分析抗体的特异性Fig 5 Western blot analyzed the specificity of anti-serum

3 讨论

为了更好地对MORF4L1 a、b变体进行生物学功能和作用机制的研究,本实验室根据2个变体的差异序列设计了多肽，并将偶联KLH载体的多肽作为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，期望能够获得单独特异识别MORF4L1 a变体的抗体，以便在实验中能够将MORF4L1 a、b变体进行区分。首先，将免疫家兔后的抗血清初步通过Dot blot鉴定其识别多肽的特异性，发现1号家兔的抗血清特异性优于2号兔，于是对1号家兔抗血清进行亲和层析纯化，以提高抗体的纯度和效价。通过ELISA和Western blot对纯化后抗体的效价和纯度进行鉴定，成功获得较高纯度和效价的抗体。为了后续鉴定抗体的特异性，成功构建了MORF4L1 a、b变体的原核表达质粒和真核表达质粒。原核表达质粒转化到表达菌E.coliBL21中，根据前期工作的经验，在16 ℃，0.2 mmol/L IPTG条件下诱导20 h成功实现重组蛋白的高丰度表达，随后采用glutathione-agarose 4B凝珠对蛋白进行纯化，纯化后的融合蛋白经考马斯亮蓝染色以及Western blot实验进行验证，成功获得纯度较高的融合有GST标签的MORF4L1 a、b蛋白。真核表达质粒转染293T细胞，使细胞瞬时表达融合有FLAG标签的MORF4L1 a、b蛋白，以此鉴定抗体识别真核表达蛋白的特异性。以市售无法区分MORF4L1 a、b变体的商品化抗体作为对照，Western blot结果显示制备的MORF4L1 a抗体能够特异性识别原核及真核表达的MORF4L1 a融合蛋白。

MORF4L1在小鼠的各组织中广泛表达，MORF4L1基因敲除的小鼠呈现胚胎死亡、细胞增殖缺陷和包括心脏在内的多种器官发育异常[5]。此外，由该小鼠建立的神经球增殖减少，分化过程中也存在缺陷，表明该染色质重塑蛋白具有调控细胞增殖和细胞命运决定的双重作用。研究发现，MORF4L1 a变体在chromo结构域插入的长度、位点和氨基酸序列各不相同，但这些亲缘关系较远的物种均在chromo结构域发生变异，表明MORF4L1的chromo结构域发生的选择性剪接在进化上具有保守性[4]。那么，MORF4L1的可变剪接在细胞增殖、发育过程中的调控作用、MORF4L1的不同变体在发育过程中各组织中的时空分布以及染色质重塑调控功能上的差异性是值得深入研究的问题。本研究中成功制备的效价高、特异性强的兔抗鼠MORF4L1 a多克隆抗体，为后续研究这些问题奠定了实验基础。