昆虫细胞表达的HPV-58 L1病毒样颗粒的层析纯化及免疫原性分析

王志荣，张 婷，许雪梅

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物物理及结构生物学系，北京100005)

高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染可诱发几乎所有的宫颈癌、部分泌尿生殖器癌和头颈癌[1]。上市的4种HPV疫苗均为主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗，分别为昆虫细胞生产的Cervarix，酵母细胞生产的Gardasil和Gardasil-9及大肠杆菌生产的Cecolin。尽管100多个国家和地区已引入HPV疫苗，但受疫苗成本高等因素影响，中低收入国家及中国的单剂以上疫苗接种率均较低，分别为4 %和2.24%[2-3]，而这些经济欠发达地区又是宫颈癌的高发区。

昆虫杆状病毒表达系统(也称作昆虫细胞表达系统，baculovirus expression vector system ，IBEVS)表达的HPV-16 L1 VLPs诱导小鼠免疫系统产生的中和抗体滴度明显高于酵母表达的[4]；Cervarix中低剂量HPV-16 L1 VLPs及等剂量HPV-18 L1 VLPs在人体诱发特异的体液免疫、细胞免疫及交叉中和抗体反应均高于Gardasil[5-7]，表明昆虫细胞生产的Cervarix的免疫原性高于酵母生产的Gardasil。二价苗Cecolin于2020年上市，其交叉保护活性数据值得研究。

与酵母细胞、大肠杆菌相比，昆虫细胞表达系统的培养成本相对较高，但宿主蛋白质较少，无内毒素，且细胞容易破碎，下游纯化工艺较简单。提高L1蛋白在昆虫细胞的表达水平及下游纯化得率是降低HPV L1 VLP疫苗成本的关键。HPV58是中国的优势高危型别。前期对HPV-58 L1基因进行了密码子优化、联合C端截短及N端截短，提高了其在昆虫细胞的表达水平[8]。本研究在上述方法的基础上首次对其C端碱性氨基酸进行了突变改造(改造后其等电点为6.8)，使其表达水平进一步提高(另文发表)。本研究采用该优化L1基因，在昆虫细胞中大量表达，并建立了生产成本低的HPV-58 L1 VLPs的纯化方法，为研发低成本、昆虫细胞表达含HPV-58 L1 VLPs的多价疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

HPV-58 L1的P3代重组杆状病毒(recombinant baculovirus)、HPV58假病毒和鼠抗Sf9多抗血清(本室保存)；草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系Sf9(Invitrogen公司)；SF-900无血清培养基(深圳壹生科有限公司)；Camvir-1(鼠抗HPV-16 L1单克隆抗体)(Millipore公司)；其他试剂均为分析纯。SPF级4～6周龄雌性BALB/c小鼠(北京华阜康生物科技股份有限公司)；5 mL HiTrap Q Sepharose Fast Flow (QFF)预装柱(GE公司)；10 mL羟基磷灰石CHT-II柱(Bio-Red公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品制备及硫酸铵沉淀：取对数增殖期的Sf9细胞2.5×106～3.0×106细胞/mL接种于1 L 摇瓶中，感染P3代病毒后，于27 ℃振荡器中80 r/min培养84 h；800 r/min离心5 min收集细胞沉淀。

PBS重悬沉淀后加入1 mmol/L PMSF，冰浴中超声破碎(100 W, 5 s/7 s, 2 min)，离心收获上清；逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终饱和度分别为25%、30%、35%，4 ℃放置2 h后4 ℃ 12 000×g离心15 min，获得蛋白沉淀。用重悬液(20 mmol/L Na3PO4, 20 mmol/L DTT, 300 mmol/L NaCl, 0.01% Tween 80, pH 8.0)重悬沉淀，加入2倍体积的稀释液(20 mmol/L Na3PO4, 20 mmol/L DTT, 0.01% Tween 80, pH 8.0)，冰上解聚2 h，0.45 μm膜过滤；Bradford法测裂解上清及硫酸铵沉淀(ammonium sulfate precipitation, ASP)中总蛋白浓度，捕获ELISA检测L1蛋白的含量[9]。

1.2.2 阴离子交换层析：用平衡液(20 mmol/L Na3PO4, 20 mmol/L DTT, 100 mmol/L NaCl, 0.01% Tween 80, pH 8.0)平衡QFF 3～5个柱体积，流速1 mL/min上样；尝试不同NaCl浓度的洗脱液分别分段洗脱并收集洗脱组分，洗脱液1(20 mmol/L Na3PO4, 20 mmol/L DTT, 100 mmol/L NaCl, 0.01% Tween 80, pH 7.0)，洗脱液2～4分别含200 mmol/L NaCl、300 mmol/L NaCl、2 mol/L NaCl，其他成分同洗脱液1。

1.2.3 羟基磷灰石层析：用QFF的洗脱液3平衡羟基磷灰石(ceramic hydroxyapatite，CHT)柱子3～5个柱体积，将QFF的阳性组分合并后上样，收集流穿及洗脱液5(200 mmol/L Na3PO4, 20 mmol/L DTT, 300 mmol/L NaCl, 0.01% Tween 80, pH 7.0)的洗脱组分。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(简称考染)及捕获ELISA鉴定各纯化组分L1蛋白的纯度[9]。纯度大于95%的组分用于体外组装。

1.2.4 组装及其特征的鉴定：纯化蛋白在含500 mmol/L NaCl的PBS(pH7.0)中透析5 d进行体外组装，动态光散射(dynamic light scattering, DLS)、透射电镜(transmission electron microscope, TEM)、Western blot (上样量为20 ng)、SDS-PAGE和考染(上样量为10 μg)及残留的宿主蛋白质(host cell protein,HCP)检测方法见参考文献[8]。

1.2.5 动物免疫及中和抗体的检测：HPV-58 L1 VLPs 0.1 μg/剂，分别于0, 2周肌肉免疫小鼠(n=5)，第4周时采集血清。超离纯化的HPV-58 L1VLPs作为对照组。HPV58假病毒中和试验检测免疫血清的中和抗体滴度见参考文献[8]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同饱和度硫酸铵沉淀L1蛋白

裂解上清分别经不同饱和度硫酸铵沉淀后，经30%饱和硫酸沉淀获得L1的纯度和得率较好，分别约为9.37%及72%(表1)。

2.2 阴离子交换层析

用含100 mmol/L或200 mmol/L NaCl缓冲液洗脱L1蛋白均不完全，仍有部分L1残留在柱子清洗组分中(结果未显示)；而300 mmol/L NaCl-缓冲液洗脱L1蛋白较完全(4/5泳道)，蛋白得率大于90%，纯度约为13.6%。此时清洗组分中未见明显L1蛋白条带(6泳道)(图1)。

1.marker; 2.lysate; 3.30% ASP; 4-5.elutions of QFF by 300 mmol/L NaCl-buffer; 6.elution of QFF by 2 mol/L NaCl-buffer; 7.flow-through of CHT; 8.elution of CHT图1 SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色鉴定经QFF及CHT两步层析纯化的HPV-58 L1蛋白Fig 1 SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining of HPV-58 L1 proteins purified by QFF and CHT

2.3 羟基磷灰石层析

L1蛋白主要在CHT流穿中(7泳道)，蛋白得率大于80%，且纯度较好，而大部分杂蛋白均经CHT洗脱去除(8泳道)。经以上3步纯化后，L1蛋白总回收率约为55.7%，合计每升细胞培养液(约3.0×109个细胞)的产量约为57～65 mg。

表1 L1蛋白的纯度及得率分析Table 1 Purity and recovery of L1 proteins in different purification n=3)

2.4 VLP的特征鉴定

DLS显示，组装蛋白颗粒的平均水力学直径为89 nm，多分散系数PDI为0.148，均一性好(图2A)。TEM显示颗粒的直径约为55 nm(图2B)，大小形态与天然病毒颗粒(含360个L1的正二十面体)类似。10% SDA-PAGE 显示，10 μg蛋白上样未见明显杂带(图2C)；Western blot显示该纯化蛋白可与Camvir-1特异性结合(图2D)；ELISA显示每微克纯化蛋白中仅含9.2 ng宿主蛋白，即L1蛋白纯度约为99.1%。

2.5 免疫活性分析

层析获得HPV-58 L1 VLPs的小鼠免疫血清中针对HPV58的平均中和抗体滴度为2 560(图3)，与超离获得VLPs对照组的3 200的相当。

3 讨论

HPV58在中国宫颈高度癌前病变中的检出率仅次于HPV-16[10]。目前仅有酵母细胞生产的Gardasil-9涵盖HPV-58。高滴度的中和抗体常预示更持久的免疫保护。昆虫细胞生产的二价疫苗免疫活性好，特别是诱发针对HPV-16/18中和抗体滴度可达酵母的6.08倍和13.1倍[5-7]。研究低成本、昆虫细胞生产HPV L1 VLPs的方法，对研发多价VLP疫苗及以VLP为载体的疫苗意义重大。本研究采用经C端碱性氨基酸突变改造等方法获得的、在昆虫细胞表达水平高的HPV58 L1基因，大量表达后收获感染细胞，进行下游纯化方案的研究，建立了成本低的层析纯化方案，获得L1蛋白纯度高达99.1%，总回收率达55.7%，即每升细胞培养液可获得57～65 mg L1 VLPs，相当于3 250剂疫苗(单剂Cervarix中每种L1 VLPs 20 μg)，因此具有进一步的研发价值。

The magnification of TEM was ×80 000, Bar=200 nm图2 动态光散射、透射电镜、SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色及Western blot分析纯化的HPV-58 L1 VLPs

图3 超离(UC)及层析(CG)纯化的HPV-58 L1VLPs免疫小鼠血清中和抗体滴度Fig 3 Neutralization antibody titers of mice immunized with of HPV-58 L1 VLPs purified either by chro- matography (CG) or ultra-centrifugation (UC)

目前已报道多种纯化L1蛋白的层析方法[8-9,11-13]，如分子筛联合阳离子结合层析、硫酸肝素多糖亲和层析[8][11]等，但分子筛的上样量小，用于蛋白初纯时难以放大工艺；亲和层析的上样量大，但成本较高。单独阳离子结合或CHT结合层析可纯化酵母表达的L1蛋白，但无法去除昆虫细胞中47 ku和100 ku的宿主杂蛋白(结果未显示)，且CHT结合-线性洗脱时，部分L1蛋白不能与杂蛋白分开，损失较大。本研究确立的纯化方案包括饱和硫酸铵沉淀、阴离子结合及CHT流穿。其中硫酸铵沉淀省时且易于操作；阴离子结合和CHT流穿不受样本体积的限制，通量大，而且蛋白经CHT流穿，省去了洗脱步骤，操作简单耗时短，且回收率高，因此，易于放大工艺，降低成本。并且纯化获得的HPV-58 L1 VLPs的免疫活性好，说明该纯化工艺条件温和，成本低且不影响免疫活性。

总之，本研究确立的HPV-58 L1 VLPs的简单可行的层析分离纯化方法，蛋白得率高、免疫活性好，且操作简单、成本低。为利用昆虫杆状病毒表达系统生产成本低的其他型别VLPs或嵌合VLPs疫苗的中试放大工艺的研究提供参考。