四川省甘孜州藏猪戊型肝炎病毒分子流行病学调查

杨丹娇 ， 张 敏 ， 何宗伟 ， 杨 珊 ， 陈亭宇 ， 王艳琼 ， 叶忠明 ， 汤 承

(1.甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所 ， 四川 康定 626000 ； 2.四川省稻城县农牧农村和科技局 ， 四川 稻城 627750 ； 3.四川省乡城县农牧农村和科技局 ， 四川 乡城 627850 ; 4.西南民族大学畜牧兽医学院 ， 四川 成都 610041)

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)引起的一种人兽共患传染病[1]。世界卫生组织(WHO)估计，全球每年有HEV感染者约2 000万例，300多万人有症状，5.6万人死于戊型肝炎病毒感染，该病已成为重要的公共卫生问题[2]。HEV不仅可以感染人类，还可以在动物中广泛分布与传播，猪源HEV可能是引起人感染戊型肝炎病毒的重要源头[3]。因此对HE流行及传播进行监测具有重要现实意义。ORF2为HEV的主要结构基因编码区，其核苷酸序列也最为保守，ORF2蛋白是HEV复制、传染性和免疫反应性的关键蛋白，存在多个抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的重要抗原表位，是目前疫苗和诊断试剂研发的主要研究抗原片段[4]。藏猪是众多畜禽品种资源中极具特色的品种之一，主要分布在四川甘孜、阿坝、青海、西藏等海拔3 000 m以上的高山或河谷地区[5]，在四川省甘孜州主要分布在稻城、乡城、康定、泸定等地。藏猪主要与高原上的其他动物(如牦牛、藏羊等)混养，与当地牧民共用水源等，这种密切接触的养殖模式加剧了人和其他动物之间疾病的跨种传播[6-7]，加剧了HEV的传播和流行。为调查四川省甘孜藏族自治州藏猪戊型肝炎病毒的流行情况，本试验采集了该地区4个县10个藏猪养殖场的229份粪便样本进行分子流行病学调查，并分析其遗传进化特征。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIzol总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、连接试剂盒，均购自TaKaRa公司；pMD19-T载体、DNA MarkerⅡ、大肠杆菌DH5α感受态细胞，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要仪器 恒压恒流电泳仪、琼脂糖水平电泳槽、超净工作台，均购自北京六一仪器厂；凝胶成像仪、PCR仪，均购自Bio-Rad公司；冷冻离心机，购自四川蜀科仪器有限公司。

1.3 临床样本 于2018—2019年采集四川省稻城、乡城、泸定、泸定4个县10个藏猪养殖场的粪便样本229份，其中腹泻粪便样本145份，临床健康藏猪粪便样本84份。所有采样的藏猪养殖场均未进行HEV疫苗免疫，所有样品均低温运输，于-80 ℃保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 RNA的提取及cDNA的合成 用TRIzol法抽提样本中总RNA。按照反转录试剂盒说明书制备cDNA。反应体系：总RNA 4 μL，5×Buffer 2 μL，oligo(dT)0.5 μL，反转录酶0.5 μL，RNase-Free Water 3 μL。反转录程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s，16 ℃保存。将cDNA放置-20 ℃保存备用。

1.4.2 引物的设计与合成 采用参考文献[8]中报道的检测引物及方法对HEV进行分子检测，目的条带为644 bp。按参考文献[9]报道的HEVORF2基因扩增的引物序列(表1)对阳性样本的cDNA进行ORF2基因部分片段扩增，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 ORF 2基因引物信息

1.4.3 反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)方法进行HEV的分子检测 以1.4.2中合成的HEV检测引物对样本的cDNA进行PCR检测。PCR扩增体系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸8 min。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.4.4 HEVORF2基因部分序列的扩增 取阳性样本的cDNA进行2轮PCR，第1轮PCR扩增体系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性 2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸10 min。第1轮PCR扩增产物作为第2轮PCR扩增模板。第2轮PCR扩增体系：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。根据凝胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，按照pMD19-T Vector Cloning Kit说明书进行连接，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4.5 HEVORF2基因序列的遗传进化分析 测序成功的基因序列，参照GenBank中公布的HEV分离毒株ORF2基因序列，使用Seqman软件进行拼接，并运用MegAlign软件将获得的ORF2基因序列与参考毒株序列进行核苷酸序列和推导的氨基酸序列比对分析，并利用MEGA 7.0软件的邻近法(Neighbor-joining)构建系统进化树。

2 结果

2.1 藏猪源HEV的分子检测 结果如表2所示，在粪便样本中，HEV核酸阳性率为16.59%(38/229，95%CI=12.00%～22.10%)；10个规模藏猪场中，HEV场阳性率为70%(7/10，95%CI=34.8%～93.3%)，腹泻粪便样本阳性率为24.14%(35/145，95%CI=17.4%～31.9%)，临床健康猪粪便样本阳性率为3.57%(3/84，95%CI=0.7%～10.1%)。部分样品的PCR扩增结果见图1。

表2 229份藏猪粪便样本HEV RT-nPCR检测结果

图1 HEV RT-nPCR扩增部分结果

2.2 HEVORF2基因扩增 利用2对ORF2基因的扩增引物，对38份阳性样本进行HEVORF2基因片段的扩增，PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现与预期长度相符的目的条带(图2)。

图2 ORF2基因的PCR扩增

2.3 HEVORF2基因核苷酸序列 对38个阳性样本进行ORF2基因的克隆测序，所得的38株ORF2基因部分序列均提交至GenBank数据库，其核苷酸序列在GenBank登录号为MK410054～MK410091。序列分析结果显示，38个序列彼此之间的核苷酸序列相似性为76.1%～100.0%，推导的氨基酸序列相似性为79.6%～100.0%，与参考毒株基因1～4型核苷酸序列相似性为75.2%～97.6%，与基因4型毒株的相似性最高，核苷酸序列相似性为75.8%～97.6%。

2.4 HEVORF2基因遗传进化分析 利用来自藏猪的38个HEVORF2基因的577 bp序列片段与来自GenBank数据库的其他38个HEV分离株的ORF2序列构建系统发育树，结果如图3所示，本试验获得的所有38个HEV序列独立为一大支，均属于G4型，与人源的HEV毒株亲缘关系最近。进一步将38株HEV菌株分为4个亚型：亚型4a(31株)、亚型4j(4株)、亚型4d(2株)和亚型4b(1株)。本试验中亚型4a明显占优势，可能在藏猪中循环。

图3 HEV ORF2部分基因序列进化树

3 讨论

在青藏高原中，藏猪、牦牛、藏羊等不同的动物在牧场中与当地牧民密切接触，共用水源与食物等[10]，在这种多样化的生态系统和自由选择的育种系统中，动物有更多的机会被HEV感染[11]，使HEV的传播和流行加剧。研究者对西藏的藏猪进行HEV流行病学调查，结果显示血清 HEV IgM和HEV IgG抗体阳性率分别为7.6%和1.8%，HEV核酸阳性率为7.6%，表明HEV感染是西藏藏猪一个严峻的地方性问题[12-13]。然而，关于HEV在藏猪中流行的信息依然有限，且藏猪HEV的分子遗传信息相对较少。因此，本试验对藏猪HEV的遗传多样性和进化关系进行了调查分析。甘孜州地处川西北高原藏区，饲养管理水平低，卫生环境差，水源污染严重等问题极易将病毒传染给其他动物[14]。然而在本试验中，藏猪粪便样本HEV核酸阳性率为16.59%(38/229)，明显高于西藏藏猪核酸阳性率7.6%(26/340)，这一结果表明，在甘孜州藏猪感染HEV更为普遍严重，戊型肝炎病毒的流行具有区域性[15]，提示相关部门要重视甘孜州藏猪HEV的防控及流行情况。意大利研究者发现，83例猪腹泻粪便样本中HEV的检出率(51.1%)明显高于159只临床健康猪粪便的检出率(13.8%)[16]。我国的一项研究发现，兔子经试验感染HEV毒株可引发腹泻[17]。已有文献报道显示，藏猪腹泻是常见病[18-19]。在本试验中，腹泻粪便中HEV的阳性率(24.14%)显著高于临床健康猪粪便样本阳性率(3.57%)，提示HEV感染可能是导致藏猪腹泻的原因。因此，鉴定与腹泻相关的HEV毒株具有重要意义。

ORF2为主要的结构基因编码区，其核苷酸序列也最为保守，ORF2蛋白是HEV复制、传染性和免疫反应性的关键蛋白，存在多个抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的重要抗原表位，是目前疫苗和诊断试剂研发的主要研究抗原片段[4]，因此研究ORF2基因具有重要的理论意义和实践指导价值。在本试验中38株藏猪源HEV毒株ORF2部分序列彼此之间核苷酸序列相似性为76.1%～100.0%，与基因4型参考毒株的核苷酸序列相似性最高为75.8%～97.6%，38株藏猪HEV毒株均属于基因4型，其中亚型4a占优势，亚型4b、4d和4j占少数；系统进化树分析显示，本试验获得的基因4型毒株与人源的毒株的进化关系较近。基因4型是近年来人主要感染的基因型，它也存在于当地的猪群中，有研究者报道四川地区生猪HEV流行毒株也是以基因4型为主[20]，人基因4型毒株的基因组序列与从同一地理区域获得的猪源基因4型毒株的基因组序列密切相关，序列相似性分析和进化树再次从基因水平提供了戊型肝炎是人兽共患病的证据[21]，具有较大的人兽共患风险。本试验结果表明甘孜州藏猪源HEV流行情况严重，以基因4型流行为主，相关部门应该加强HEV在人和畜禽之间传播的综合防控，其具有重要的公共卫生学意义。