兰州烤羊肉中腐败微生物的分离与鉴定

◎ 尚洁昊，常程程，丁梓雪，孟宪刚

（兰州交通大学，甘肃 兰州 730000）

兰州处于我国西北地区，多民族聚居，饮食结构多元化，甘肃又是我国的养殖业大省，每年有20多万吨羊肉被本地消费[1]。羊肉制品中，烤羊肉是深受人们喜欢的品类。烤羊肉串是将新鲜的羊肉除去筋膜，将血水洗净，切成小块，经过调味料腌渍后串烤而成。由于烤羊肉串即食的特征，使国内对烤羊肉串的防腐保鲜研究较少，这也限制了烤羊肉串的产业化发展。烤羊肉属于低温肉制品，低温肉制品是一类在标准大气压下通过熏、煮、烤和蒸等烹饪工艺处理后，使肉制品的中心部位的温度达到75～85 ℃的新型肉类制品[2]。低温肉制品保持了肉本身的组织与结构和其天然的成分，正是这种肉制品的特性，使它成为我国肉制品未来进步的方向和趋势。但由于低温肉制品的加工场所开放、灭菌不完全，致使低温肉制品非常容易发生腐败，产品货架期短，必须采用冷链的方式运输和保存，在很大程度上限制了低温肉制品的发展[3]。如何在最大程度上抑制或消除腐败微生物生长繁殖，抑制肉制品当中的各种酶对脂肪酸败、蛋白质的氧化分解，保持肉制品的原有滋味与营养成分，是低温肉制品保鲜的主要目标。

肉制品之所以发生腐败变质，主要是由微生物造成的，致使肉本身的颜色发生变化并出现异味，影响肉制品的食用。还有些微生物会把肉中的蛋白质逐渐分解成其他化合物，产生气味，进一步促使肉制品的腐败变质[4]。目前，国内外一些研究人员针对低温肉制品品质低、产品保水能力低、保油能力低、色泽不持久和产品货架期短等问题，进行了腐败菌分布、生长衰退规律及优势腐败菌的分离鉴定。刘彩云等人[5]发现魏斯氏菌和佐氏库特氏菌这两种菌是导致市售卤牛肉腐败的优势菌。宋相宇等人[6]采用高通量测序技术，探究了不同包装及储存温度对于白切鸡中微生物菌群结构的影响，发现白切鸡优势菌属都是假单胞菌属。

由于低温肉制品杀菌工艺和储藏条件与新鲜胴体、高温肉制品有很大不同，本研究试从市售烤羊肉中分离出导致烤羊肉腐败的微生物，并对腐败菌进行鉴定，以确定导致市售烧烤羊肉腐败的主要微生物，意在为烤羊肉制品的储存、延长货架期等问题的解决提供借鉴，也能更好地将当地特色的烤肉制品推广销售至全国，拓展销路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

兰州市安宁区某烤肉店烤制的羊肉串。

FA2004N电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）、DHP-9012电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、SW-CJ-2G型双人净化工作台（苏州净化设备有限公司）、LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、SHA-B双功能水浴恒温振荡器（常州天瑞仪器有限公司）、TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）和T100PCR仪（伯乐）。

1.2 培养基

LB固体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 L。

察氏固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L。

高氏固体培养基：淀粉20 g，硝酸钾1 g，磷酸氢二钾0.5 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

样品采集于兰州市安宁区某烧烤店，将烤制完成的羊肉用真空包装袋真空包装，并标记样品名称，放置常温保存。

1.3.2 烧烤肉制品污染微生物的培养

在超净工作台上，取5 g肉样剪碎，放进含有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶内。通过充分振荡制成的1∶10均匀稀释液。按照腐败情况进行梯度稀释，稀释为10-1～10-6。将稀释后的溶液吸取200 μL，分别加到1.2中3种固体培养基中，进行涂布，之后放在恒温培养箱32 ℃，培养48 h。

在778份样本中，共检出10份HPV18阳性，检出率1.3%（10/778），其中4份为多重感染。HPV18感染者年龄最小31岁，最大58岁，中位年龄40岁。

1.3.3 烧烤肉制品的污染微生物的分离与纯化

将3种培养基上生长的微生物菌落挑出单菌落，反复划线进行纯化。观察记录菌株的形态、边缘、颜色和透明度、菌体是否隆起等生物学性状。

1.3.4 DNA的提取

模板的获取：在超净工作台中，用接种环分别挑取单菌落到0.2 mL离心管中，加入10 μL无菌水，标记，96 ℃煮沸10 min，迅速放于-20 ℃冷冻5 min（循环3次），4 000 r·min-1离心1 min，吸取2 μL上清液作为DNA模板。

PCR参数：94 ℃预变性5 min；主循环94 ℃变性0.5 min；55 ℃退火1.5 min；72 ℃延伸1.5 min；循环30次；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保存。

引物为16S rDNA通用引物27F和1492R，以菌体的DNA为模板进行PCR扩增。反应体系如表1。

表1 PCR反应体系表（25 uL）

1.3.5 16S rDNA测序

将扩增出菌株的DNA片段送到生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

将测序获得16S rDNA序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对分析，后选取近似菌种序列采用MAGE 7.0软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 腐败菌株的菌落特征

经过梯度稀释涂布和多次划线培养，在LB琼脂培养基上筛选得到3株菌株，分别命名为Y1、Y2、Y3号菌。LB琼脂培养基上菌落形态见表2。

表2 LB琼脂培养基上菌落形态表

2.2 腐败菌的革兰氏染色鉴定结果

革兰氏染色是细菌学中广为采用鉴别细菌的一种方法，根据细菌细胞壁的主要成分的不同，通过染色结果可使细菌分为两大类，即G+与G-[7]。在分离纯化试验中，在腐败的烧烤羊肉中分离纯化出3株菌，采用革兰氏染色法将这3个菌株进行革兰氏染色，用100倍油镜观察。菌体染色结果均为革兰氏阳性菌。Y1、Y2呈杆状，Y3呈短杆状，椭圆、两端钝圆。

2.3 腐败菌的分子生物学鉴定结果

由图1可知Y1为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、Y2为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、Y3为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。

图1 基于16S rDNA序列同源性的菌株的系统发育树图

3 结论与讨论

以往研究证实，影响低温肉制品货架期的关键因素是腐败菌的生长繁殖[8]。低温肉制品由于制作过程温度低，杀菌不完全，导致肉制品中会残有细菌芽胞、真菌孢子和部分耐热细菌等微生物，在日后的贮存和销售过程中，存留的微生物在肉中经过短暂的修养、复苏后将会再次进行生长繁殖，最后会引起肉制品的感官品质下降、导致其腐败变质，影响了肉制品货架期[9]。本实验结果发现，在市场出售的烧烤羊肉制品中，芽孢杆菌是导致烤羊肉腐败的主要腐败菌。烧烤肉制品在制作过程中，高温处理虽能够杀死一部分不耐热的微生物，但有些细菌的芽孢仍能在高温处理下存活下来。当然也存在一些由于烤制不彻底而残留在肉制品内部的微生物。因此，导致烧烤羊肉制品腐败的优势菌大多为芽孢杆菌，这一结果与其他学者在传统菜肴中分离鉴定出的优势腐败菌一致[10-11]。

本研究对常温条件下市售烤制羊肉中的腐败菌进行分离纯化，并通过菌落形态学观察和16S rDNA分子鉴定等方法，对肉中的腐败菌进行了分离鉴定。结果表明，在烤羊肉上分离得到Y1、Y2、Y3 3株菌，分别是地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌。这些腐败菌主要是由会产生芽孢的芽孢杆菌组成的，是引起烧烤羊肉腐败的主要菌株，同时也是影响产品货架期的先决条件。本研究为烧烤羊肉制品加工、贮藏过程中有针对性地控制微生物污染提供借鉴和参考，并且为下一步防腐保鲜提供可用的方法，也为延长烧烤羊肉制品的货架期提供了理论根据。