茯苓功效成分茯苓酸的研究进展

徐德宏，谭朝阳，郑 慧，张芳铭，侯凤飞，戴鑫汶，李 玲，杨 勇,3,*

（1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南补天药业股份有限公司，湖南 怀化 418100；3.湖南省茯苓工程技术研究中心，湖南 怀化 418100；4.湖南中医药大学人文与管理学院，湖南 长沙 410208）

茯苓又称玉灵、松柏芋、茯菟等，主要产于云南、湖南、湖北、安徽、贵州等地，是多孔菌科真菌Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其大小不一、形块无定，表皮深褐色或浅褐色，内质白色或稍带粉红色，中医认为茯苓味甘、淡、平，归心、脾、肾经，具有利水渗湿、健脾宁心之功效，临床主要用于治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、便溏泄泻、心神不安、惊悸失眠等症状[1]，《神农本草经》将茯苓列为“安魂养神，不饥延年”之上品，中医有“十方九苓”之说法，故茯苓作为食药同源功能性原料在保健食品领域有着十分广泛的应用[2]。茯苓的保健功能涉及抗肿瘤、降血糖、改善睡眠和增强免疫力等方面，是具有重要开发价值的保健食品资源。

茯苓含多糖、三萜、甾醇、挥发油、蛋白质、氨基酸、核苷酸及微量元素等多种化学成分[3]，其三萜类物质因种类多样且活性显著而广受关注。目前从茯苓中发现和鉴定的三萜类成分按照碳骨架结构主要分为羊毛甾-8-烯型、羊毛甾-7,9(11)-二烯型、3,4-开环-羊毛甾-8-烯型和3,4-开环-羊毛甾-7,9(11)-二烯型4种类型[4]。研究显示茯苓三萜具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、美白及免疫调节等多种药理作用[5]。茯苓酸（pachymic acid，PA）为羊毛甾-8-烯型三萜（图1），分子式C33H52O5，相对分子质量528.763，单一纯品为白色粉末，是茯苓的重要三萜成分之一，也是茯苓中除多糖外广受关注的茯苓功效成分。本文对PA提取检测、药理活性、生物合成和茯苓的健康应用等方面进行系统论述，拟为PA在中医药健康食品领域的基础研究和应用开发提供参考。

图1 PA的分子结构Fig. 1 Molecular structure of pachymic acid

1 茯苓酸的提取与检测

作为最受关注的茯苓三萜类成分，PA在茯苓中的总体含量并不高，因此如何高效提取是深入研究与应用的前提和基础。马巾媛等[6]对PA提取溶剂进行了对比研究，结果显示5种提取溶剂（甲醇、无水乙醇、乙醚、氯仿和丙酮）中甲醇提取PA得率最高，若辅助超声可进一步增加提取产量。兰新财等[7]在单因素试验的基础上，采用正交试验法对PA的乙醇提取工艺参数进行了考察，得到最佳工艺参数为：乙醇体积分数85%、料液比1∶6、提取温度55 ℃、提取时间1 h。

高效液相色谱法是目前PA含量测定的主要方法，目前常采用的分析条件一般为：C18色谱柱，检测波长为210 nm，乙腈-磷酸溶液或甲醇-磷酸溶液为流动相梯度洗脱，流速和柱温分别为1 mL/min和30 ℃[8-10]。该方法操作简便、专属性好且稳定可靠，可作为茯苓原料中PA含量的分析方法[10]。

茯苓产地和产品等级对其PA含量有重要影响（表1），野生茯苓一般比栽培茯苓中PA含量高，高海拔略寒冷地区比沿海、平原及热带地区所产茯苓品质要优，所含PA含量也更高[11-15]。研究结果体现了“顺境出产量，逆境促品质”的中药材栽培品质规律，故在实际种植和使用茯苓时，需重视茯苓药材的道地性，以及气温、湿度等生态环境对茯苓规范化种植的影响。段启等对茯苓与茯苓皮PA含量进行了测定，结果显示茯苓皮PA含量远高于茯苓[16]，相关研究结果也支持了这一研究结论[17-19]。李蒙等对茯苓、茯神、茯神木及松根PA含量进行比较，结果显示茯神木PA含量最高，茯神次之，茯苓最少，而松根未有PA的检出[20]。宋潇比较了茯苓皮、茯神、赤茯苓和白茯苓的PA含量，结果表明PA含量为茯苓皮＞茯神＞赤茯苓＞白茯苓[21]，该结果显示茯苓颜色越深的部位一般PA含量越高，因而市场价格较低的茯苓皮因其PA含量相对较高，在实际生产中可作为提取PA的主要原材料。

表1 不同产地和等级茯苓中PA质量分数比较Table 1 Comparison of pachymic acid contents in P. cocos from different habitats and grades

2 茯苓酸的药理活性

PA是茯苓三萜类成分的重要代表，现代药理研究表明其具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、镇静催眠等多种药理活性[22]，下面拟对其相关研究进行分类总结和分析。

2.1 抗肿瘤作用

抗肿瘤活性在PA全部药理活性中报道最多，其抗瘤机制主要有两种：一是通过多种机制促进肿瘤细胞凋亡，从而实现直接抑瘤效果；二是通过促进肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性，从而实现间接抑瘤效果（表2）。癌症是当今影响人类生命健康的一种重大疾病，PA具有的抗肿瘤功效使茯苓成为中医药健康食品开发利用的重要资源，可用于预防和辅助治疗癌症，同时也为研发和生产茯苓相关功能产品带来了强盛的市场需求和可观的经济价值。

表2 PA抗肿瘤机制Table 2 Anti-tumor mechanism of pachymic acid

2.2 抗炎和抗氧化作用

炎症或氧化应激与人体较多的慢性病和亚健康病理机制相关。由于茯苓在慢性病康复和亚健康干预方面具有较好疗效，故其在保健领域中应用广泛。茯苓具有良好的抗氧化和抗炎作用[3]，其三萜成分PA在该方面的作用机制也备受关注，相关研究结果[47-60]显示PA可通过抑制促炎因子分泌、调节炎性蛋白和酶类活性、调控相关信号通路，实现抗炎和抗氧化作用（表3）。

表3 PA抗炎和抗氧化作用机制Table 3 Anti-inflammatory and antioxidant mechanisms of pachymic acid

2.3 降血糖作用

Huang Yuchuan等[61]通过实验证实，PA在6种茯苓三萜中具有最强的促葡萄糖吸收活力。进一步机制研究发现，PA可提高葡萄糖转运体（glucose transporters，GLUT）4在3T3-L1脂肪细胞中的表达量，刺激GLUT4从细胞内小泡向质膜的再分布，同时增加胰岛素受体底物-1、Akt和AMP激活激酶（AMP-activated kinase，AMPK）的磷酸化，从而增强3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取能力。此外，PA在分化的脂肪细胞中可诱导甘油三酯积累并抑制其分解。另一项对茯苓三萜降血糖的研究显示，PA可显著降低db/db小鼠的血糖水平，而且对链脲佐菌素处理的小鼠可增强其胰岛素敏感性[62]。PA的降血糖作用为茯苓的降血糖保健作用提供了科学支持，也为茯苓作为降血糖健康食品的应用与开发提供了可靠依据。

2.4 镇静催眠作用

《神农本草经》中记载茯苓具有“安魂养神”之功效，其三萜成分PA对此可能发挥作用。Shah等[63]研究发现，口服PA能显著抑制小鼠的运动活力，且与其他镇静催眠药物合用时具有协同效应，例如与麝香醇合用时可缩短入睡时间，与戊巴比妥合用时则延长睡眠时间。进一步机制研究显示，PA可增加γ-氨基丁酸受体的α和β-亚基水平，但降低γ-亚基水平，故PA通过γ-氨基丁酸能系统延长戊巴比妥钠诱导下啮齿动物的睡眠行为[63]。睡眠障碍已成为当今社会一种常见的“流行性疾病”，化学药物治疗睡眠毒副作用明显，而以天然药物成分或中药为原料开发改善睡眠的保健食品或药品具有更高的安全性。PA改善睡眠作用的实验研究结果从物质基础层面验证了茯苓的中医安神功能，可作为改善睡眠功能因子应用于保健食品。

2.5 抑制脏器移植排斥反应

Zhang Fan等对大鼠心脏移植后，PA保护外周血淋巴细胞免于凋亡的效应进行了研究，结果显示PA可通过稳定外周血淋巴细胞线粒体跨膜电位来抗凋亡，其作用具有专一性，即稳定外周血CD8+淋巴细胞数量百分比，避免其异常增高，而对外周血CD4+淋巴细胞既不影响其凋亡，也不调节其细胞数量百分比[64]。在此基础上，李春雨等对PA抑制心脏移植急性期排斥反应进行了研究，结果显示PA低剂量组、PA高剂量组和环孢菌素A组心肌病理损害较对照组明显减轻[65]。综合以上结果，可以证明PA对心脏移植急性期排斥反应具有较好的抑制作用，有望将其开发成一种抗脏器移植排斥作用的新型免疫调节药物。

2.6 改善多囊卵巢综合征作用

PA具有抗炎、抗氧化和降血糖等多方面的药理作用，而多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）的发生受炎性细胞因子、活性氧和高胰岛素血症影响，因此现代研究表明，PA与PCOS的治疗有关。Fu Xianpei等[66]对其治疗PCOS的作用进行了研究，结果显示PA与阳性药物二甲双胍具有相似的药理作用，且在改善脂肪组织炎症和线粒体异常方面优于二甲双胍，以上这些发现提示PA能改善PCOS小鼠的内分泌环境和卵母细胞质量，因而PA是具有潜在PCOS治疗作用的药物分子。

2.7 其他药理作用

周宏超等[67]对PA治疗仔猪水肿病的机制进行了探索，结果显示PA可通过抑制SLT-IIe诱导肠黏膜微血管内皮细胞分泌的细胞因子，缓解肠道微循环障碍，阻止微血栓形成，实现治疗水肿病之目的。袁园等[68]在血管紧张素（angiotensin，Ang）II诱导下，探讨了PA对H9c2细胞肥大和凋亡的影响及其机制，结果发现，5 μmol/L的PA能显著影响1 μmol/L AngII处理24 h后的H9c2细胞，可显著下降其细胞表面积和凋亡比例。进一步机制研究揭示PA显著下降JNK的磷酸化水平，但不影响细胞非信号调节激酶和p38的磷酸化，故推测PA通过抑制JNK减轻AngII诱导的H9c2细胞肥大和凋亡。王伟等[69]发现PA对改善C57小鼠梗阻性肾积水间质纤维化具有较好效果，其机制主要是下调转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1、磷酸化Smad蛋白（phospho-Smad protein，pSmad）2/3、MMP-9的表达来实现。此外，PA还具有调控5羟色胺3A受体活性[70]、抑制脂多糖诱导的NO生成[71]、抗枯草芽孢杆菌[72]等其他一些药理活性。

3 茯苓酸的生物合成

PA具有多种重要药理保健活性，预示其在医药与食品领域的应用价值较高。传统提取PA的方法由于受到茯苓资源和品质的限制很难满足市场需求，而PA作为三萜类化合物，其分子结构相对复杂，一般通过化学合成获得PA的想法较难实现。当前，生物合成PA已取得一系列进展，有可能成为PA有效单体高效获取的新途径。

崔培梧等[73]对茯苓菌液态深层发酵进行了研究，并探讨了4种氧载体（正己烷、正十二烷、吐温-80、Triton X-100）对发酵后菌体生长、茯苓多糖和PA生物合成的影响。结果显示，吐温-80是最合适的一种氧载体，且发酵48 h后在10 L反应器中添加1.0%（体积分数）吐温-80，可使菌丝在继续发酵168 h后PA产量达到989.52 μg/L，比未加吐温-80的发酵体系提高25%[73]。余梦瑶等开发了两种茯苓固体发酵菌质，两者在发酵茯苓60 d后都可得到较高产量的PA[74]。Jin Jian等通过液相色谱-质联用手段对天然茯苓（茯苓皮和茯苓肉）和发酵菌丝体所含物质和含量进行比较，结果发现发酵菌丝体中PA含量为0.61 mg/g，显著高于天然茯苓[75]。以上研究结果都说明，通过对茯苓菌进行发酵和工艺技术改进有可能提升PA含量，因而发酵培养手段有希望成为传统提取手段的一种较好替代方案。

Shu Shaohua[76]、陈杰[77]等研究发现茯苓菌丝在三萜化合物（包括PA）含量显著高于菌核，因此对两者进行了比较转录组学研究，结果显示甲羟戊酸途径是茯苓中三萜化合物唯一生物合成途径，而且一些关键基因在菌丝阶段差异性表达造成了三萜化合物含量的差别；在此基础上，刘影[78]结合液相色谱-质谱联用技术对菌核提取物进行了定性和定量分析，从中发现了5种与PA碳骨架一致的化合物，分别为羊毛甾醇、栓菌酸、16α-羟基栓菌酸、齿孔酸（依布里酸）和土莫酸，并由此预测了从羊毛甾醇到PA的生物合成途径（图2）。在该预测途径中，由栓菌酸生成土莫酸的途径需进一步确定，因为根据郭继云等报道的茯苓甾醇C-24甲基转移酶（Poria cocossterol C-24 methyltransferse，PcSMT）1基因实际功能来看，其催化栓菌酸24 位碳原子甲基化生成齿孔酸[79]，因而据此可推测土莫酸应先由栓菌酸生成齿孔酸，然后再由齿孔酸16位碳原子羟基化生成土莫酸，但在刘影[78]的检测结果中不仅发现了齿孔酸，还发现了16α-羟基栓菌酸，因此，土莫酸还可能存在先由栓菌酸在16位碳原子上羟基化生成16α-羟基栓菌酸，再由16α-羟基栓菌酸24位碳原子甲基化得到土莫酸的合成路径（图2）。此外，随着对PA生物合成途径的不断解析，陆续有研究团队对该途径中一些重要步骤的催化酶类进行了基因克隆和功能分析（表4）。以上研究成果为将来利用合成生物学和代谢工程方法改造茯苓或其他工程微生物，进而利用发酵培养手段大规模生产PA奠定了一定的理论基础。

图2 PA生物合成途径预测Fig. 2 Predicted pachymic acid biosynthesis pathway

表4 PA生物合成途径中已克隆的酶基因及其功能分析Table 4 Cloned enzyme genes in pachymic acid biosynthesis pathway and their functional analysis

4 茯苓在保健食品、药品领域的应用

目前，单以PA作为主要成分的保健食品和药品鲜有相关报道，但以茯苓作为主要成分的产品则较多，故对茯苓相关药品和保健食品进行总结，拟从侧面评估PA在大健康领域的应用价值和前景。通过检索国家特殊食品信息查询平台（http://ypzsx.gsxt.gov.cn/specialfood/#/food）可以获知，截至2021年8月，已有118种茯苓相关保健产品得到了批准文号，其涵盖了免疫调节、睡眠改善、疲劳缓解、肠胃改善等多种保健功能（图3）。此外，通过检索国家药品监督管理局药品查询系统，可以发现茯苓常作为原料参与一些中成药的制备，这些中成药多以丸、片、胶囊、颗粒等剂型出现。以上有关茯苓药品和保健食品研发的报道，为日后进一步在医药和食品领域开发PA奠定了基础。

图3 茯苓在保健食品领域的应用Fig. 3 Application of P. cocos in healthcare products

5 结 语

“十方九苓”说明茯苓的中医临床应用广泛，药理作用多样，而以PA为代表的茯苓三萜同样展现多样的药理活性。基于本文所综述的研究现状，笔者认为在医药与保健食品领域PA的基础研究和开发利用还有以下问题值得深入探讨。

首先，在未来较长一段时间内，以茯苓作为原料进行PA提取依然是PA的主要获取途径，因此在茯苓的规范化种植、加工处理、饮片炮制、提取方法和工艺等方面的创新将有助于PA产量的提升。例如，李习平等考察了不同加工处理方式对茯苓和茯苓皮中PA含量的影响[83]，其结果提示PA对热压不稳定，故在今后改进或创新茯苓的加工处理、饮片炮制、提取方法和工艺时，要防止长时间的高温高压对PA的破坏。

其次，作为食药同源材料茯苓的功效成分，围绕肿瘤防治、睡眠改善和血糖降低等功能食品需求，开发以PA或茯苓为组方的保健食品或特医食品具有很好的前景。比如，由于PA不仅可直接抑癌还可协同化疗和放疗进行间接抗癌，故针对癌症病人开发以PA为主要成分，或直接以茯苓为主料开发增敏化疗或放疗作用的特医食品，已经具备一定的科学性和可行性。此外，中医记载茯苓具有宁心安神功能，而现代药理研究证实PA具有镇静催眠作用，因此研发以PA或茯苓为主要原料，用于改善失眠状况的保健食品具有一定的科学依据，其在安神助眠功能性保健食品中必定具有良好的应用前景。

最后，PA的生物合成途径已逐渐得到解析，负责催化这些代谢途径的酶类也渐渐被发掘和验证，这为利用基因工程手段提高PA产量奠定了基础，但到目前为止鲜有通过改造茯苓菌自身生物合成途径提高PA产量的直接研究，也鲜有通过异源构建PA完整生物合成途径代谢生成PA的报道，因此在PA生物合成研究上应积极解决这些基础研究问题，从而早日实现利用代谢工程方法大规模生产PA的愿景。

综上所述，食药同源材料茯苓所含的PA具有多样的药理活性，是潜在的保健食品或特医食品的功能活性成分。基于PA与茯苓整体药理作用具有很强的相类性规律，以PA为代表的茯苓三萜类成分，很有可能成为继茯苓多糖后在食品领域新的研究热点。