重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体N糖谱的定性及定量分析

刘冰，王梦莹，肖志良，董衍东，邹寒艳，杨惠洁，张伶俐

1.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121；2.AB SCIEX亚太应用支持中心，广东广州 510623

临床上，单克隆抗体用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病，是近年生物制药行业最热门的研究领域之一［1-2］。重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体是一种特异性靶向淋巴细胞表面CD20抗原的抗体，可与CD20抗原发生结合，激发机体免疫反应，可致表面表达CD20抗原的B-淋巴细胞的溶解和被杀伤，从而达到抗肿瘤效果［3］。单克隆抗体具有复杂的结构和功能，且存在不同类型的翻译后修饰，其中糖基化是最常见和复杂的修饰之一，主要形式为N糖基化修饰［4］，其差异可能会影响其药学性质，如有效性、体内半衰期及免疫原性等［5-8］。因此，N糖基化修饰是单克隆抗体生产工艺和质量控制的重要指征，对其进行分析和监控非常必要［9］。

单克隆抗体N糖基化修饰通常采用N糖谱来进行定性和定量分析，2-AB标记法为常用的检测法，即N糖链通过糖苷酶F酶切释放，用2-AB对游离N糖进行标记衍生，再经液相色谱进行分离检测。该方法可作为N糖谱分析的定量方法，也可串联质谱进行糖型鉴定，但该方法操作繁琐且耗时较长。RapiFluor-MSN糖分析试剂盒采用不同的糖苷酶和衍生试剂，实现了对N糖链的快速释放和标记，从而大幅提高了样品的处理效率。本实验采用RapiFluor-MSN糖分析试剂盒对重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体进行前处理，分别通过液质联用仪和液相-荧光检测对N糖谱进行定性和定量分析，同时与2-AB标记法进行比较［10］。

1 材料与方法

1.1样品 重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体（10 mg/mL）由重庆市食品药品检验检测研究院生物制品室提供。

1.2主要试剂及仪器 Glycoworks RapiFluor-MSN糖分析试剂盒（包含RapidPNGase F糖苷酶、Rapi-Gest SF缓冲液、RapiFluor-MS标记试剂、二甲基甲酰胺溶剂、GlycoWorks HILIC Elution 96孔板、色谱柱Waters ACQUITY UPLCGlycan BEH Amide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A）和Waters UPLCH-class购自美国Waters公司；2-氨基苯甲酰胺和甲酸铵购自美国Sigma公司；N糖苷酶F（PNGase F）及N糖纯化小柱（GlycoCleanTMSCartridges）购自美国Prozyme公司；超滤管购自德国Sartorius公司；乙腈购自美国Fisher Scientific公司；ABSciex Triple TOF 5600型超高液相色谱-质谱联用仪购自美国ABSCIEX公司；Agilent1260高效液相色谱仪-荧光检测器购自美国Agilent公司。

1.3Rapi Fluor-MS标记处理 取15μg重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体样品，加入6μL 5%Rapi-Gest SF缓冲溶液，再加入纯水至终体积28.8μL，混匀，95℃温育3 min，冷却至室温；加入1.2μL Ra-pidPNGase F糖苷酶，混匀，55℃温育5 min，冷却至室温；加入12μLRapiFluor-MS标记试剂，混匀，室温放置5 min；加入358μL乙腈，混匀，用Glyco-Works HILICElution 96孔板对标记的N糖进行纯化，用30μL洗脱液（含200 mmol/L醋酸铵的5%乙腈溶液）洗脱N糖3次；向洗脱液中加入100μL DMF和210μL乙腈，混匀，用于质谱鉴定及液相-荧光鉴定。

1.42-AB标记处理 取25μL经超滤管脱盐后的重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体（10 mg/mL），加入5μL PNGase F和70μL 10 mmol/L的PBS，混匀，37℃水浴20 h；加入-20℃预冷的乙醇300μL，混匀，-20℃放置1h；15300×g离心10 min，取360μL上清液，干燥，加入20μL 2-AB标记试剂，混匀，65℃孵育4 h；加至预处理过的纯化小柱中，吸附约20 min；依次加入1 mL乙腈、5×1 mL 96%乙腈/水溶液、3×0.5 mL纯水进行纯化洗脱，收集洗脱液，完全干燥；用100μL 70%乙腈水溶液复溶，完全溶解，15 300×g离心1 min，取上清液，用于液相-荧光鉴定。

1.5质谱鉴定 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC Glycan BEHAmide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A）。柱温：60℃，进样量：5μL，流动相A：乙腈，流动相B：50 mmol/L甲酸铵（pH 4.5），38.5 min内B相：22%→44.1%，流速：0.5mL/min，激发波长：260 nm，发射波长：430 nm。采用ESI离子源，正离子模式，离子源温度：450℃，喷雾电压：5 000 V，去簇电压：30 V，母离子扫描范围：500~2 000 m/z，子离子扫描范围：100~2 500 m/z。

1.6液相-荧光定量检测 色谱柱为Waters ACQUITY UPLCGlycan BEH Amide（1.7μm，2.1 mm×150 mm，130 A），色谱条件同1.5项，按面积归一化法计算各糖型相对含量［11］。

2 结果

2.1质谱鉴定结果 共检测到10种N糖类型，主要糖型为G0F-GN、G0、G0F、Man5、G1F和G2F，其中G1F存在两种异构形式：G1F（1，6）和G1F（1，3），各糖型检测的m/z值误差均在理论值的±5 ppm以内，见图1、表1和图2。表明液质联用可对RapiFluor-MS试剂盒处理后的N糖链进行有效的鉴定区分，有助于液相-荧光检测对N糖的定量分析。

图2 质谱测定各糖型的结构示意图

表1 质谱糖型的鉴定结果

图1 质谱测定各糖型的相对分子质量

2.2液相-荧光定量检测结果 液相-荧光鉴定到的主要糖型与质谱鉴定相同，N糖链以岩藻糖修饰的糖型为主（G0F、G1F、G2F），其中G0F含量最高，约占总糖型的50%，同时含有少量去岩藻糖修饰糖型（G0）和高甘露糖糖型（Man5）。2-AB标记法检测到的主要糖型的种类与RapiFluor-MS标记法一致，主要糖型占总糖型的比例均达90%以上，且同一糖型之间的相对含量差异较小。见图3和表2。

表2 两种定量方法检测主要糖型的含量（%，±s，n=3）

表2 两种定量方法检测主要糖型的含量（%，±s，n=3）

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图3 两种定量方法检测的N糖图谱

3 讨论

重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体的作用机制主要包括抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC）和促细胞凋亡［3］。研究表明，N糖链岩藻糖修饰对ADCC有较大影响［12］，N糖链末端半乳糖含量与CDC活性呈正相关［13］，且高甘露糖含量会影响体内半衰期［14］，某些特殊糖型（如α-1，3-半乳糖等）会增加免疫原性［15］。因此，为确保产品的有效性和安全性，对单克隆抗体N糖基化修饰进行质量控制，有效地监控糖型的改变和糖型比例的变化十分必要。

本实验采用RapiFluor-MSN糖型标记法结合液质联用仪及液相-荧光检测对重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体N糖进行定性和定量分析，结果表明，液质联用可对RapiFluor-MS试剂盒处理后的N糖链进行有效的鉴定区分，液相-荧光定量检测到的主要糖型与质谱鉴定相同，N糖链以岩藻糖修饰的糖型为主（G0F、G1F、G2F），其中G0F含量最高，约占总糖型的50%，同时含有少量去岩藻糖修饰糖型（G0）和高甘露糖糖型（Man5）。2-AB标记法检测到的主要糖型的种类与RapiFluor-MS标记法一致，主要糖型占总糖型的比例均达90%以上，且同一糖型之间的相对含量差异较小。与2-AB标记法比较，RapiFluor-MS标记法操作更为简便、快速，该方法使用的糖苷酶可使糖蛋白快速释放糖链，且不影响灵敏度和重现性，RapiFluor-MS标记试剂含有高反应活性的NHS-氨基甲酸酯标记基团，可对糖链进行快速标记，大幅缩短了样品制备时间，整个样品处理过程可控制在30 min内。2-AB标记衍生法操作复杂且耗时较长，仅去糖基化和标记过程就长达24 h，还需对样品进行脱盐、浓缩等处理。另外，RapiFluor-MS标记法所用样品量较少，仅需15μg蛋白质，适用于来源有限及珍贵样品；2-AB标记法完成一次N糖谱分析则需要250μg蛋白质。在单克隆抗体制品的检验中，生产企业及监管单位应基于明确的产品表征信息，选择合适的分析方法，对单克隆抗体N糖链进行合理的质量控制。