鸦葱提取液对水痘-带状疱疹病毒体外增殖作用的影响

周莹，张夫坤，孙跃秋，王梦涵，袁琳，秦臻，岳玮，顾建阳，沈德新

1.长春祈健生物制品有限责任公司，吉林长春 130000；

2.解放军联勤保障部队第九八八医院儿科，河南郑州 450042

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）是带状疱疹（herpes zoster，HZ）的病原体。HZ症状为单侧皮肤簇集疱疹，常伴有剧烈的神经病理性疼痛，易遗留顽固的后遗神经痛。HZ及后遗神经痛发病率随着年龄的增长呈上升趋势［1］，且可反复发作，持续期长，并发症增多，严重影响患者的身心健康、劳动能力及生活品质。至今，临床上尚无安全有效的特异性治疗方法。

鸦葱（Scorzonera albicaulis Wild）属菊科鸦葱属，多年生草本植物，具有清热解毒、消肿散结的功效［2］。鸦葱中含有丰富的抗病毒活性成分，如黄酮类化合物、酚酸类（咖啡酸及其衍生物）、倍半萜及其苷类、三萜及三萜苷类、香豆素等［3-5］。有研究表明，鸦葱鲜品白汁外敷可治疗HZ，使疼痛明显减轻，皮损消退65%以上，但作用机制尚未明确［2］。本实验通过水煎煮法制备鸦葱提取液，探讨其对VZV体外增殖的影响，以期为鸦葱用于HZ的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1细胞、毒株及质粒 人胚肺二倍体成纤维细胞2BS株（2BS细胞）、VZV（病毒滴度为5.2 lgPFU/mL）及重组质粒标准品（ORF62）均由长春祈健生物制品有限公司提供。

1.2鸦葱 鸦葱全草采自河南省驻马店泌阳县种植基地，由河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定为华北鸦葱（Scorzonera albicaulis Bunge），晒干，备用。

1.3主要试剂 MEM培养液购自日本日水制药株式会社；新生牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司；CCK8试剂盒（货号：C0038）购自碧云天生物技术有限公司；病毒DNA提取试剂盒（货号：Er201-01）购自北京全式金生物技术有限公司；Premix Ex TaqTM（ProbeqPCR，货号：RR390A）购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.4鸦葱提取液的制备

1.4.1鸦葱原液的制备 取500 g鸦葱鲜叶洗净晒干，截小段，匀浆破碎，得鲜汁200 mL，依次用脱脂棉和纱布将鲜汁过滤芯2次，经150 mm定性滤纸过滤约12 h；过滤液经9 168×g离心10 min，取上清，依次经0.45和0.22μm微孔滤膜过滤，制备为鸦葱原液，浓缩至1.4 g/mL，分装小瓶，于115℃灭菌30 min；冷藏备用。

1.4.2鸦葱水提液的制备 取30 g鸦葱全草干燥品，截小段，用8.5倍水浸泡0.5 h；于800℃煮沸，400℃稳火煎煮40 min；去渣，经脱脂棉-定性滤纸-离心-砂芯过滤（同1.4.1项），制备为鸦葱水提液，浓缩至0.12 g/mL，分装小瓶，115℃灭菌30 min；冷藏备用。

1.5细胞培养 将2BS细胞用含10%新生牛血清的MEM培养液（含1%双抗、1%谷氨酰胺和3%碳酸氢钠），于37℃进行常规培养。

1.6细胞毒性试验 将2BS细胞按5×105个/mL的浓度接种至96孔板，于37℃培养过夜；分别加入不同浓度的鸦葱提取液（18.75、37.5、75、150、300、600、1 200、2 400和4 800μg/mL），同时设空白孔（仅加入MEM培养液）及对照孔（加入2BS细胞及MEM培养液），于37℃，5%CO2培养箱培养3 d；弃上清，每孔加入10μL CCK8溶液和90μL MEM培养液，继续培养3 h；用酶标仪检测A450，并按下式计算细胞存活率。

细胞存活率（%）=（实验孔A450-空白孔A450）/（对照孔A450-空白孔A450）×100%

1.7鸦葱提取液对V Z V体外增殖影响的检测 用含2%新生牛血清的MEM培养液将鸦葱原液配制成200、100和50μg/mL 3个浓度，将鸦葱水提液配制成50、25和5μg/mL 3个浓度。将2BS细胞按2×106个/mL的浓度接种至24孔板，37℃培养过夜；加入VZV，200μL/孔，37℃吸附1 h；弃培养液，加入含2%新生牛血清的MEM培养液，继续培养，分别于2、4、6、8 h加入不同浓度的鸦葱原液和鸦葱水提液，每个浓度均设3孔，同时设阳性对照（仅加病毒，不加鸦葱原液和鸦葱提取液），置37℃，5%CO2培养箱中培养3 d，进行考马斯亮蓝染色，观察并计数。选择抑制率较好的药物浓度和给药时间点的结果进行拍照，随机选取6个噬斑，24孔板的孔直径为14.0 mm，采用Oplenic 10.1软件对噬斑面积进行测量计算。

1.8鸦葱提取液对V Z V培养过程中病毒载量影响的检测 采用实时荧光定量PCR法。qPCR扩增上游引物（ORF62）：5′-TCTCGACTGGCTGGGACTTG-3′，下游引物（ORF62）：5′-CGCCGCGCGCTCTCTTT-3′，探针：5′-HEX-CGTAAACGATCATCCGGTGGACACACATAMRA-3′［6］，引物及探针由吉林省库美生物科技有限公司合成。将2BS细胞以8×106个/mL浓度接种至6孔板，用含2%新生牛血清的MEM培养液将鸦葱原液及鸦葱水提液分别配制成200和50μg/mL，按1.7项中的方式加入VZV（0.1 mL，396.22 PFU/mL）和鸦葱提取液，同时设病毒对照组（仅加VZV病毒，不加鸦葱原液和鸦葱提取液），置37℃，5%CO2培养箱中培养3 d；收集细胞，经-70℃冻融破碎后，92×g离心10 min，收集病毒，采用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，以其为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系为：Premix Ex Taq（Probe qPCR）10μL，上下游引物各0.4μL，Probe0.8μL，模板2μL，ddH2O补足至20μL。PCR扩增条件为：预变性95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，共40个循环。以重组质粒标准品（108copies/μL）作为VZV qPCR检测标准品，绘制标准曲线，计算病毒载量［7］。

1.9统计学分析 应用GraphPad Prism 8软件进行数据整理、制作图表及统计分析，计量值均采用均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用Kruskal-Wallis-t检验，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1细胞毒性试验 鸦葱原液和鸦葱水提液的半数毒性浓度（TC50）分别为501.9和239.1μg/mL，鸦葱原液和水提液浓度分别为200和75μg/mL时，其细胞存活率均达80%以上，表明鸦葱原液和水提液分别在200和75μg/mL浓度以下时对2BS细胞毒性较小。见图1。

图1 鸦葱原液（A）和水提液（B）的半数毒性浓度Fig.1 TC50 of bulk（A）and extract（B）of Scorzonera albicaulis Bunge

2.2鸦葱提取液对V Z V体外增殖的影响

2.2.12BS细胞形成的噬斑数 50、100和200μg/mL浓度的鸦葱原液均能抑制VZV增殖，且呈浓度依赖性，VZV感染2 h后加入200μg/mL的鸦葱原液对VZV增殖影响最明显（t=10.41，P<0.01），其抑制率可达90%以上。50和25μg/mL的鸦葱水提液可抑制VZV增殖，在VZV感染后2 h加入50μg/mL的鸦葱水提液对VZV增殖影响最明显（t=12.14，P<0.01），其抑制率可达75%以上。见图2。上述结果表明，鸦葱原液和鸦葱水提液均可有效抑制VZV增殖，在感染后2 h给药的抑制效果最佳。

图2 鸦葱原液（A）及鸦葱水提液（B）对VZV在2BS细胞上产生噬斑数量的影响Fig.2 Effect of bulk（A）and extract（B）of Scorzonera albicaulis Bunge on count of plaques on 2BScells infected with VZV

2.2.22BS细胞形成的噬斑面积 根据2.2.1项结果，选择200μg/mL鸦葱原液2h给药、50μg/mL鸦葱水提液2 h给药及病毒对照的结果进行拍照，计算VZV在2BS细胞形成的噬斑面积。鸦葱原液组、鸦葱水提液组及病毒对照组噬斑面积分别为（0.42±0.21）、（0.95±0.32）和为（1.62±0.47）mm2，鸦葱原液组和鸦葱水提液组噬斑面积明显小于病毒对照组（t分别为5.710和5.710，P分别＜0.001和＜0.05）。见图3。

图3 各组2BS细胞形成噬斑Fig.3 Plaques formed on 2BScells in various groups

2.3鸦葱提取液对病毒载量的影响 鸦葱原液和鸦葱水提液均可抑制VZV的病毒数量，病毒载量明显低于病毒对照组，且差异有统计学意义（t分别为4.343和2.437，P分别＜0.01和＜0.05）。在VZV感染2 h时给药的病毒载量最低，与2.1项结果相符，见表1。

表1 各组2BS细胞于不同时间点的病毒载量（log10 copies/μL，±s，n=3）Tab.1 Virus loads of 2BS cells in various groups at various time points（log10 copies/μL，±s，n=3）

表1 各组2BS细胞于不同时间点的病毒载量（log10 copies/μL，±s，n=3）Tab.1 Virus loads of 2BS cells in various groups at various time points（log10 copies/μL，±s，n=3）

注：与病毒对照组比较，a表示P＜0.05，aa表示P＜0.01。

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3 讨论

我国中药药材种类繁多，多种中草药提取物均具有良好的抗病毒活性［6，8-12］。新鲜鸦葱白汁外敷可治疗HZ，应用前景广泛。

病毒的生命周期包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配分泌等不同阶段，每个阶段均是潜在的药物靶点。以阿昔洛韦为代表的抗疱疹西药抑制病毒DNA的复制和合成，药物靶点为病毒DNA聚合酶。而鸦葱含有多种抗病毒活性成分较多，其中黄酮类可影响疱疹病毒的吸附、进入、复制、病毒蛋白翻译、病毒衣壳糖蛋白的形成及病毒的释放等多个过程［13］；酚酸类阻止病毒蛋白与宿主细胞表面的吸附从而阻碍病毒进入细胞［13］；三萜及其苷类能强烈抑制VZV吸附宿主细胞［14］；醌类化合物可持续提供自由基，与亲核氨基酸形成不可逆结合，抑制蛋白质的正常功能［15］；多糖类-硬葡聚糖多糖能够阻止病毒与细胞质膜复杂的相互作用［16］。

本实验通过噬斑形成和qPCR试验结果表明，一定浓度的鸦葱原液、鸦葱水提液均可抑制VZV在2BS细胞中的增殖，可直接破坏VZV感染2BS细胞的能力，表明鸦葱具有良好的抗VZV活性，在细胞水平多环节中起到抑制效果，但具体的分子机制有待于进一步深入研究，同时需开展模式动物实验进行体内效果验证。另外，本实验使用的鸦葱原液及鸦葱水提液仅为粗提物质，需进一步精细分离提取有效成分，进行更深入的研究，以期筛选出低毒性、高药效、新靶点的抗病毒中药成分。