人血白蛋白中常见可见异物成因及控制分析

焦旭雯，梁蔚阳，陈宇堃，蒋玉辉，陈龙少

广东省药品检验所国家药品监督管理局血液制品质量控制重点实验室，广东广州 510663

人血白蛋白是由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法或经批准的其他分离法分离纯化，并经60℃10 h加温灭活病毒后制成。《中国药典》三部（2020版）通则0904可见异物检查法中规定，可见异物是指存在于注射剂、眼用液体制剂和无菌原料药中，在规定条件下目视可观测到的不溶性物质，其粒径或长度通常＞50μm［1］。由于人血白蛋白在生产和贮存过程中易产生蛋白颗粒聚集物，使蛋白质在产品有效期内发生变化，可能会明显地检测到蛋白絮或蛋白颗粒，其可见异物存在水平普遍高于化学药品。本文对人血白蛋白中常见可见异物的形成原因、控制方法、安全限度的制订、精密仪器检测结果相关性等进行示范性研究，旨在此基础上，探索聚集体形成的原因，为拟定科学合理、具有引导性的可见异物研究与标准制订指导原则提供依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 3批人血白蛋白可见异物阳性样品（根据异物类型、蛋白颗粒聚集情况分为9份样品，分类情况见表1）、1批静注人免疫球蛋白（pH 4.0）批签发样品及1批人纤维蛋白原委托样品由不同企业提供；TOSOHTSKGELG3000SW（7.5mm×600 mm）色谱柱购自日本东曹株式会社；B-2澄明度检测仪购自天津大学精密仪器厂；GWF-8JDS微粒分析仪购自天津天河分析仪器有限公司；AccSizer 780全自动颗粒计数分析仪购自美国PSS-NICOMP公司；Agilent 1100高效液相色谱仪购自美国Agilent公司；2100AN浊度计购自美国HACH公司。

表1 3批人血白蛋白可见异物阳性样品基本信息Tab.1 Basic information of three batches of sample containing visible particles

1.2可见异物检测 按《中国药典》三部（2020版）通则0904可见异物检查法第一法（灯检法），将澄明度检测仪照度调节为4 000 Lx，分别将9份样品置于黑、白背景下观察。

1.3不溶性微粒检测 按《中国药典》三部（2020版）通则0903不溶性微粒检查法第一法（光阻法），采用GWF-8JDS微粒分析仪对9份样品进行检测。每个供试品容器中含10和10μm以上的微粒数不得超过6 000粒，含25和25μm以上的微粒数不得超过600粒。

1.4大粒子检测 采用全自动颗粒计数分析仪，基于光阻（光消减）原理的单粒子光学传感技术进行测定。用系列标准粒子建立粒径与强度信号大小的校正曲线。仪器测得样品中粒子通过光感区产生的信号，根据校正曲线计算出粒子的粒径及加权体积。直接用聚四氟乙烯管线将9份高浓度样品注入仪器中，由仪器自动稀释至合适的浓度后进行检测。

1.5多聚体含量检测 按《中国药典》三部（2020版）通则3121人血白蛋白多聚体测定法，采用Agilent 1100高效液相色谱仪，以TOSOHTSK GEL G3000SW（7.5 mm×600 mm）为色谱柱，流动相为含1%异丙醇的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0），流速为0.6 mL/min，检测波长为280 nm，对9份样品的多聚体、二聚体及单体含量进行测定。

1.6浊度检测 采用浊度计对9份人血白蛋白可见异物阳性样品、1批静注人免疫球蛋白（pH 4.0）批签发样品及1批人纤维蛋白原委托样品进行浊度检测。分别量取浊度标准贮备液［《中国药典》三部（2020版）附录0902，浊度为4 000 NTU］0、0.125、0.25、0.5 mL，加水稀释并定容至100 mL，制成浊度值分别为0、5、10、20 NTU的标准液。取浊度标准液测定浊度，以读数和标准液浊度绘制标准曲线；将样品放至比浊仪中，读数，计算结果。

2 结果

2.1可见异物 结果显示，样品中可见异物主要表现为白点（指不能辨清平面或棱面的白色物体）、色点（指带有颜色的不能辨清平面或棱角的物体）、纤毛（指细小的纤维），见图1。

图1 典型阳性样品图（灯检法）Fig.1 Typical positive samples（lamp test）

2.2不溶性微粒 结果显示，9份样品不溶性微粒均符合规定，见表2。

表2 不溶性微粒检测结果Tab.2 Test results for insoluble particles

2.3大粒子 结果显示，随着蛋白颗粒聚集的不同程度，粒径为40~70μm的大粒子所占比例呈增加趋势，见图2和表3。

表3 不同粒径粒子数所占百分比（%）Tab.3 Percentages of particles at various diameters

图2 PSSAPS380全自动颗粒计数分析仪Y9典型图谱（光阻法）Fig.2 Typical charts of PSS APS380 fully-automatic particle counting analyzer（light blockage method）

2.4多聚体含量 结果显示，白点、色点、纤维等阳性样品差别不大，但不同程度蛋白颗粒聚集的阳性样品多聚体含量趋势平稳，二聚体含量略高，见图3和图4（以Y9为例）。

图3 多聚体、二聚体含量趋势图Fig.3 Trend of polymer and dimer contents

图4 高效液相色谱图Fig.4 HPLCchromatogram

2.5浊度对比 浊度测定标准曲线见图5。各批阳性样品浊度值（3.8~4.3 NTU）与人纤维蛋白原（20.0 NTU）、静注人免疫球蛋白（pH 4.0）（10.9 NTU）浊度值相比，无明显差异。《中国药典》三部（2020版）人纤维蛋白原、静注人免疫球蛋白（pH 4.0）等品种外观项下均规定可带轻微乳光，考虑浊度大小与品种本身特性有关。

图5 浊度测定标准曲线Fig.5 Standard curve for turbidity test

3 讨论

通过9份样品不溶性微粒、全自动颗粒计数、多聚体含量、浊度等项目的检测数据可发现，不溶性微粒检测结果易受气泡、硅油及蛋白质聚集产生的多聚体或沉淀［2］的影响，白点、色点、纤维等阳性样品（Y1~Y6）差别不大，但不同程度蛋白颗粒聚集的阳性样品（Y7~Y9），全自动颗粒计数结果与二聚体含量趋势一致。

产生可见异物的风险的工艺关键点包括原液制备、配液、无菌过滤、灌装，还包括西林瓶清洗、灭菌及干燥，胶塞清洗、灭菌及干燥。结合人血白蛋白生产工艺，生产过程中温度控制至关重要，是常见可见异物产生的关键因素［3］。人血白蛋白样品中如出现可见异物，各生产工序、关键工艺控制参数、物料、设备均有所关联，需对蛋白分离过程、蛋白精制、灭活、蛋白分装、蛋白孵育等过程进行全面调查。人血白蛋白生产过程中对温度要求较高，融浆温度、融浆循环水温、组分Ⅰ、组分Ⅱ+Ⅲ、组分Ⅳ、组分Ⅴ制作温度、超滤透析液温度均需严格控制。由于温度升高后出现沉淀反溶，杂蛋白去除不彻底，影响产品纯度，造成产品质量不稳定［4］。因此，在后续孵育、存放过程中可能有蛋白颗粒析出，导致产品可见异物不符合要求。通过对批签发资料汇总，对人血白蛋白生产过程中各组分沉淀温度进行比对，发现各企业组分Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ、Ⅴ制作温度差异较大，组分Ⅳ制作温度较为集中，主要为-5和-7℃。结合灯检结果，组分Ⅳ-1、Ⅳ-4制作温度低，有利于降低白点检出率。

通过对企业生产工艺的研究，发现本文中可见异物阳性样品（Lot1和Lot2）在产品分装后段由于分装泵来回摩擦，产生热量，从而导致蛋白变性。主要发生在分装后期，经更换分装泵后，情况有所缓解。可见异物阳性样品（Lot3）在组分Ⅳ制作过程中，蛋白分离间内压缩空气限压阀故障，导致反应罐反应液达到-4.4℃，不利于杂蛋白沉淀，造成本批次产品总灯检合格率较低。产品中出现的白点，主要为不稳定蛋白颗粒。

血液制品在生产过程中出现异常情况，蛋白颗粒的聚集是这类异物产生的关键，由于在配液和过程阶段均处于溶解状态，过滤器并不能拦截这类异物，当出现振荡、压力、摩擦、温度变化等诱发因素后，蛋白聚集形成可见异物。通过4种检测方法对样品进行测定，发现可见异物阳性样品的不溶性微粒、浊度检测结果仍符合《中国药典》三部（2020版）规定，但二聚体含量、粒径＞50μm的大粒子所占比重呈增加趋势。

综上所述，企业在对人血白蛋白可见异物进行灯检法的同时，通过测定二聚体含量、粒径＞50μm的大粒子所占比重对生产线上的产品进行在线监督，有利于探索聚集体形成的原因，以评估产品总体质量［5-7］。