表达诺如病毒衣壳蛋白的重组腺病毒疫苗的构建及其免疫原性分析

王金冬，马亚林，毛彤瑶，段招军

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，北京 102206

诺如病毒（norovirus，NoV）属于杯状病毒科 （Caliciviridae）诺如病毒属（Norovirus），是一类无包膜的单正链RNA病毒，也是导致病毒性急性胃肠炎（acute gastroenteritis，AGE）的重要病原体之一。NoV基因全长约为7 500个核苷酸，包括3个开放阅读框（open reading frame，ORF）［1］。ORF1编码6种非结构蛋白（non-structural protein，NSP），参与病毒的复制过程。ORF2编码主要衣壳蛋白VP1，该蛋白相对分子质量约为59 000，可自组装产生在形态和抗原性上与天然病毒粒子相似的病毒样颗粒（virus like particles，VLP）［1］。VP1由S区和P区两个结构域组成，S区主要参与二十面体衣壳的形成，P区构成衣壳外的突起部分，包含NoV主要中和位点，可与组织血型抗原（histo-blood group antigen，HBGA）受体和抗体结合［2］。ORF3编码次要结构蛋白VP2，该蛋白可能与病毒的组装以及维持衣壳蛋白稳定性有关［1］。

NoV可感染多个年龄阶段的人群，特别是5岁以下的婴幼儿。在轮状病毒疫苗得到大范围推广的发达地区，NoV感染已成为儿童病毒性胃肠炎的最主要病因［3］。目前，NoV被分成10个基因组（GⅠ~GⅩ），其中大多数的人类感染与GⅠ和GⅡ病毒株有关，特别是GⅡ.4，是过去几十年最主要的流行株，造成50%~70%的暴发［4］。GⅡ.4 NoV具有高度变异性，每2~4年就会出现新的变异株，取代以往的优势流行株。GⅡ.4 sydney株为一种新的变异株，2012年首次出现于澳大利亚，其后在世界多个国家和地区造成大规模暴发流行，也是我国近年来最常见的报告毒株［5］。

由于缺乏有效的药物和治疗手段，疫苗的推广和使用是控制NoV感染最有效的方式。但NoV疫苗的研发目前存在较多困难，原因之一是缺乏细胞培养系统和广泛可用且成功的动物模型，导致减毒活疫苗、灭活疫苗等传统疫苗的研究受阻，同时限制了非传统疫苗的研发和后续评价。近期有研究发现，人类NoV可在B细胞和人肠道干细胞分化的肠上皮细胞（human intestinal enteroid，HIE）中进行培养，但由于病毒复制效率过低，该技术目前尚不能用于疫苗研发［6］。因此，NoV疫苗的研究方向主要集中在VLP、P颗粒等亚单位疫苗以及重组腺病毒载体疫苗等［7-9］。其中研究最为深入的是VLP疫苗，目前已有多家公司和机构的研究成果进入临床实验阶段［9-10］。复制缺陷的5型腺病毒（HAdV5）载体是开发新型强效疫苗最有前途的平台之一，具有转导效率高，免疫效果好等优点［11-12］。HAd5虽然不是肠道病毒，但其易于在人类和其他物种中传递，且具有诱导黏膜免疫的潜力，具有广阔的应用前景［11］。美国Vaxart公司目前正在研发一种基于HAd5载体的口服NoV重组腺病毒疫苗，该疫苗使用双链RNA作为佐剂，能有效提高体液免疫和黏膜免疫水平［13］。该研究目前已进入临床阶段。

本研究以HAd5为载体，构建包含ORF2（VP1）、ORF3（VP2）和3′UTR区的新型重组腺病毒载体疫苗，并与单独表达VP1的重组腺病毒疫苗进行对比，评价新型疫苗诱导小鼠体液、黏膜和细胞免疫应答的能力。

1 材料与方法

1.1质粒、病毒及细胞 携带NoVGⅡ.4 sydney 2012（GenBank：OK148516）VP1、VP2和3′UTR区的质粒（puc-VP1-2）由金唯智生物科技有限公司合成；纯化后的NoV GⅡ.4 P颗粒由中国疾病预防控制中心病毒性腹泻室提供；改良后的腺病毒载体pkAd5ES和HEK293细胞株由中国疾病预防控制中心洪院士实验室鲁茁壮老师惠赠。

1.2实验动物 BALB/c小鼠18只，雌性，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：110011211109361851。本实验均以科研为目的对小鼠进行养殖和使用，且按照中国疾控中心病毒病预防控制所动物伦理相关规定进行（20201020058）。

1.3主要试剂及仪器 常用限制性内切酶和同源重组酶购自美国New England Biolab公司；RIPA细胞裂解液购自碧云天生物技术公司；转染试剂Lipfectamine 3000为美国Invitrogen公司产品；2×Trans-Start®FastPfu Fly PCR SuperMix、HRP标记的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG和抗β-actin小鼠单克隆抗体购自北京全式金生物技术股份有限公司；诺如病毒VP1和VP2兔源多克隆抗体购自美国GeneTex公司；HRP标记的羊抗小鼠IgA和链霉亲和素购自美国Abcam公司；聚丙烯酰胺（PPA）-biotin标记的H双糖购自新西兰GlycoNZ公司；小鼠淋巴细胞分离液、小鼠IFNγELISPOT检测试剂盒和小鼠IL-4 ELISPOT检测试剂盒购自达科为生物技术股份有限公司；自动细胞计数仪Countess3购自美国Thermo公司。

1.4重组腺病毒的构建 以puc-VP1-2质粒为模板，分别扩增VP1（含CMV启动子）和VP1+VP2+3′UTR（含CMV启动子）序列。利用Primer Premier 5软件设计引物，VP1上游引物：5′-ATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGC-3′，下游引物：5′-TATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTCACAGGGCTCTTCTTCTG-3′；VP1+VP2+3′UTR区上游引物与VP1同，下游引物：5′-CTATCTAGATCCGGTGGATCGGATATCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAAGACA-3′。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃20 s，62℃20 s，72℃40 s，共35个循环；72℃延伸5 min后，电泳回收目的片段。将两种PCR扩增产物通过同源重组的方式分别插入改造后的pkAd5ES腺病毒载体中，获得两种重组腺病毒质粒。在外源基因插入位点两端设计1对通用引物，对重组质粒进行PCR鉴定。上游引物：5′-TTGGGCGTAACCGAGTAAGA-3′，下游引物：5′-AATTGCATTCATTTTATGTTTCAG-3′。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃20 s，50℃20 s，72℃40 s，共35个循环；72℃延伸5 min。将扩增片段送至北京擎科生物科技有限公司测序。使用Lipfectamine 3000将鉴定正确的重组腺病毒质粒转染HEK293细胞，7～10 d后观察细胞病变情况。重组腺病毒经大量扩增后，采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化，TCID50法测定病毒滴度。

1.5外源基因表达的鉴定 将HEK293细胞按2×105个/孔接种6孔板，37℃，5%CO2培养箱内培养过夜。分别感染纯化后等剂量的pkAd5ES、pkAd5ESVP1和pkAd5ES-VP1-2重组腺病毒。感染48～72 h待细胞完全病变后收集细胞，各加入100μL RIPA裂解液，冰上放置2 min，13 000×g离心5 min，取上清，采用Western blot法检测VP1和VP2在细胞中的表达情况：将处理后的蛋白样品经12%SDSPAGE分离后转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入诺如病毒VP1、VP2兔源多克隆抗体（均1∶1 000稀释）和抗β-actin小鼠单克隆抗体（1∶2 000稀释），室温孵育1 h；PBST洗涤3次，分别加入HRP标记的羊抗兔和羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释），室温孵育1 h；ECL发光试剂盒曝光显色。

1.6动物免疫及标本采集 将小鼠随机分为3组：对照组（pkAd5ES）、VP1组（pkAd5ES-VP1）和VP1-2组（pkAd5ES-VP1-2），每组6只。禁食12 h后给予100μL重组腺病毒，108IU/只。所有小鼠均采用灌胃给药。共免疫2次，间隔3周，每次免疫前采集小鼠血液和粪便，进行特异性IgG和IgA抗体检测。加强免疫2周后处死小鼠，采集血液、粪便和脾脏，进行ELISA和ELISPOT检测。

1.7小鼠血清特异性IgG和IgA抗体检测 采用ELISA法。将小鼠血液样本室温静置1～2 h，3 000×g离心20 min分离血清，待检。取小鼠新鲜粪便样本，按照10%（W/V）加入无菌PBS，13 000×g离心10 min，取粪便上清待检。将纯化的NoV GⅡ.4 P颗粒加入ELISA板中，4℃包被过夜；PBST洗板3次，以5%脱脂奶粉于37℃封闭1 h；加入倍比稀释的待测血清或粪便上清，同时以免疫前小鼠血清或粪便上清作为阴性对照，进行同比例稀释，37℃孵育1 h；加入HRP标记的羊抗鼠IgG或IgA（1∶10 000稀释），37℃孵育1 h；洗板后加入TMB显色液，室温避光作用10 min；加入1 mol/L磷酸终止反应，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度值。样本孔A450值高于阴性对照孔2.1倍以上，且大于0.2判为阳性，阳性孔所对应最大稀释倍数为抗体效价。将阴性血清（IgG滴度＜20）和粪便样本（IgA滴度＜5）分别判为1和0，以用于统计学分析。

1.8HBGA结合阻断试验 将纯化的GⅡ.4 P颗粒加入96孔板中，4℃包被过夜；加入5%脱脂奶粉，37℃封闭2 h；PBST洗板后，将小鼠血清2倍系列稀释，加入板中，37℃孵育1 h，同时设未加血清阻断的孔作为对照；加入聚丙烯酰胺（PPA）-biotin标记的H双糖，4℃反应过夜；加入HRP标记的链霉亲和素（1∶2 000稀释），37℃孵育1 h；TMB避光显色10 min；1 mol/L磷酸终止反应，酶标仪读取波长450 nm的吸光度值。比较小鼠血清封闭前后的A450值。阻断效价50%（BT50）指加入血清后能使NoV P颗粒与寡糖的结合效率下降50%，即与未加血清阻断的对照组相比，A450值下降至少50%的最高血清稀释度［14］。

1.9小鼠脾脏淋巴细胞IFNγ和IL-4水平的检测 采用ELISPOT法。采用颈椎脱臼法处死小鼠，取出脾脏，用小鼠淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，在自动细胞计数仪Countess3上进行活细胞计数。按照试剂盒说明书进行ELISPOT操作：将细胞按4×105个/孔铺板，加入GⅡ.4特异性刺激物刺激培养24 h；用冰冷的去离子水裂解细胞，重复洗涤后加入生物素标记的抗体（1∶1 000稀释），37℃孵育1 h；洗板后再加入HRP标记的酶标亲和素（1∶1 000稀释），37℃作用1 h；加入配置好的AEC显色液，室温避光静置5～30 min；根据斑点生成情况选择终止显色时间，对阳性斑点计数。

1.10统计学分析 使用GraphPad Prism 8软件的One-way ANOVA对实验数据进行分析。抗体滴度取对数后进行统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1重组腺病毒的包装及外源基因表达的鉴定

2.1.1重组腺病毒质粒的PCR鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，pkAd5ES、pkAd5ES-VP1和pkAd5-ES-VP1-2的PCR扩增产物分别可见178、2 944和3 820 bp的目的条带，大小均与预期相符，见图1。

图1 pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2的PCR鉴定Fig.1 Identification of pkAd5ES-VP1 and pkAd5ES-VP1-2 by PCR

2.1.2病毒滴度 经大量扩增和纯化后，重组腺病毒pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2以及pkAd5ES（空载体）的病毒滴度分别为3.4×109、2.4×109和5×109IU/mL。

2.1.3VP1和VP2外源基因表达的鉴定 Western blot分析显示，pkAd5ES-VP1和pkAd5ES-VP1-2感染细胞中均可检出VP1蛋白条带，大小约59 000，但两者的表达量无明显差异；VP2蛋白条带仅在pkAd5ES-VP1-2感染细胞中检出。提示两种重组病毒均能在真核细胞中高效表达外源基因。见图2。

图2 Western blot分析重组腺病毒感染HEK293细胞后VP1和VP2的表达情况Fig.2 Western blotting of expressions of VP1 and VP2 in HEK293 cells infected with recombinant adenoviruses

2.2小鼠血清特异性IgG和IgA抗体滴度 ELISA结果显示，灌胃2周后，VP1和VP1-2组小鼠血清VP1特异性IgG抗体滴度约为102，显著高于对照组（P分别为0.020 8和0.043 4）；加强免疫后，试验组与对照组差距进一步加大（P<0.000 1），抗体滴度达103左右。初次免疫和加强免疫后，VP1和VP1-2组之间差异均无统计学意义（P分别为0.996 6和0.984 1）。初次免疫后，VP1-2组小鼠粪便中IgA抗体水平明显升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P=0.000 1）；加强免疫后，试验组IgA抗体水平进一步升高，且VP1-2组明显高于VP1组（P=0.005 7）。见图3。

图3 灌胃后各组小鼠体内VP1特异性IgG（A）和IgA（B）抗体水平的变化Fig.3 VP1-specific IgG（A）and IgA（B）antibody levels in mice in various groups after oral immunization

2.3HBGA s阻断试验 VP1-2组小鼠血清抗体对GⅡ.4 P颗粒与寡糖结合的阻断效价（BT50＞50）明显高于VP1组（BT50＜10），见图4。

图4 灌胃后小鼠血清抗体对P颗粒与HBGA结合的阻断效果Fig.4 Blocking effect of serum antibody on binding of P particles to HBGA of mice after oral immunization

2.4小鼠脾脏淋巴细胞IFNγ和IL-4水平ELISPOT结果显示，与VP1组比较，VP1-2组小鼠脾脏淋巴细胞内VP1特异性IFNγ和IL-4分泌细胞的数量明显增多，特别是IL-4（P=0.016 7），见图5。

图5 小鼠脾脏淋巴细胞内IFNγ（A）和IL-4（B）分泌水平的变化Fig.5 Levels of IFNγ（A）and IL-4（B）in spleen lymphocytes of mice

3 讨论

在所有疫苗分类中，减毒活疫苗能够提供最有效持久的免疫保护，但由于NoV难以进行体外培养，导致减毒活疫苗、灭活疫苗等传统疫苗的研发受限，而病毒载体疫苗提供了一种类似活疫苗的方法，为高效NoV疫苗的开发提供了思路。非复制型Ad5腺病毒载体是一种成熟且安全有效的疫苗平台，目前已参与了多种重要传染性疾病疫苗的研发，如埃博拉、流感、COVID-19等，部分疫苗已在国内上市［15-17］。HAd5载体目前面临的最大问题是预存免疫（preexisting immunity，PEI）的影响，针对载体的抗体会削弱外源抗原的免疫效果。有研究发现，黏膜免疫可绕过PEI的影响，诱导针对编码抗原的显著免疫反应［11，18］。而且黏膜感染是腺病毒的固有特征，重组腺病毒疫苗通过黏膜免疫有望获得较高的转导效率。黏膜免疫的途径有很多种，包括口腔、鼻腔、直肠、结膜以及阴道，黏膜免疫疫苗研究的关键是选择合理有效的黏膜免疫途径［19］。口服接种是黏膜免疫的主要方式之一，其具有较好的免疫学优势和成本效益，包括易接种，能刺激较强的黏膜免疫反应，以及诱导强大的系统免疫等，尤其适用于经粪口途径传播的病原体［20］。但口服免疫同样会受低pH值、蛋白水解酶和胃肠道环境中生物屏障的影响，限制疫苗的吸收［20］。考虑口服疫苗的低效性，可通过增加疫苗免疫剂量来提升免疫效果，但这可能会增加免疫耐受的风险。因此，增加疫苗抗原的表达水平或提高其免疫原性是提升口服疫苗效力的重要手段之一。

VP2是ORF3区编码的次要结构蛋白，位于病毒衣壳内部。该蛋白在杯状病毒中相对保守，在病毒复制或组装中发挥重要作用。有研究表明，VP2能有效促进NoV VP1的表达，并提高其VLP的稳定性，而且可能参与调节宿主的免疫反应［1］。在载体疫苗中共表达VP1、VP2蛋白以及3′末端的基因调控序列能够提高VP1特异性细胞免疫和黏膜免疫反应［21］。

本研究以HAd5为载体分别构建了包含NoV VP1（pkAd5ES-VP1）以及VP1+VP2+3′UTR区（pkAd5ESVP1-2）的两种重组腺病毒载体疫苗，并通过免疫动物比较两者的免疫原性。两种重组腺病毒包装时间为8 d左右，VP2的插入并未影响病毒的包装效率。Western blot检测发现，VP1和VP2蛋白在感染细胞中高效表达，但VP2和3′UTR区的插入并未显著增加VP1蛋白的表达量，这与其他研究结果不符［24］。本研究中VP2对免疫效果的影响可能更多与VP2蛋白本身有关。两种重组腺病毒在免疫2周后均能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，加强免疫后血清总IgG水平进一步增强。但无论是初次免疫还是加强免疫，VP1和VP1-2组之间并未出现明显差异，说明VP2的存在对IgG的提升并无明显效果。粪便IgA是反应黏膜免疫最重要的指标，本研究结果显示，与对照组相比，初次免疫后VP1-2组的IgA抗体水平明显升高，且加强免疫后进一步增强，VP1-2组显著高于VP1组，表明VP2能有效促进IgA抗体水平的增高，提升黏膜免疫效果。中和抗体是疫苗评价最关键的指标，但由于NoV难以进行体外培养，中和试验无法开展，目前多采用HBGAs阻断试验替代中和试验［14］。HBGAs是一类复杂的碳水化合物，包含岩藻糖的寡聚糖，大量分布于呼吸道、肠道、泌尿生殖道的黏膜上皮细胞以及唾液、血液等体液中。不同的NoV基因型可能结合不同类型的HBGA。GⅡ.4结合谱最广，可结合大部分HBGA分子，包括H抗原［23］。本实验通过检测GⅡ.4 P颗粒与H双糖的结合作用是否被阻止，以评价血清抗体的中和效果。试验结果表明，在血清总IgG相当的情况下，VP1-2组的阻断效果明显高于VP1组，表明VP1-2组产生了较多的中和抗体，这可能与VP2蛋白的插入有关，该蛋白上可能包含某些中和抗原位点，刺激多余中和抗体的产生，但由于VP2主要位于病毒衣壳内，该观点未得到佐证。IFNγ和IL-4水平是反应细胞免疫功能的重要指标。本研究通过ELISPOT方法对免疫小鼠的脾脏细胞进行检测，经特异性刺激后，VP1-2组产生的IFNγ和IL-4 SFC的数量多于VP1组，表明口服免疫中VP2的加入对细胞免疫具有一定的刺激效果。

目前尚无NoV疫苗上市，研究者从不同方面对NoV疫苗进行创新研究，以期获得更好的免疫效果。本研究将VP1+VP2+3′UTR区（VP1-2）作为抗原包装进腺病毒载体中，实验结果证实，相对于包装VP1的重组腺病毒疫苗，VP1-2疫苗在口服免疫时能有效提升IgA、中和抗体以及IL-4水平。VP2是否可作为NoV重组载体疫苗的重要组成，以及采用不同免疫剂量、不同接种方式产生的免疫效果是否存在差异，仍需进一步研究。