二陈汤对Lewis肺癌移植瘤生长及Hedgehog通路蛋白表达的影响

屈 直，王 芬，李志明，张燕娜，王玥慧

(1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学东方医院，北京 100078)

肺癌目前是世界上病死率占第一位的癌种[1]。其病因尚不明确,吸烟和空气污染是两个重要的危险因素。其他风险因素，如职业暴露(石棉、氡气)，也在肺癌的发展中发挥重要作用[2-3]。 二陈汤是中西医临床治疗肺癌痰瘀互结证的基本方，前期已有大量实验研究表明了它具有一定的抑制肺癌生长的作用[4-7]。Hedgehog通路在肺癌中具有促进肿瘤生长及转移的作用[8]。本研究以二陈汤作为主要干预手段，以Lewis肺癌小鼠作为主要研究对象，采用免疫组织化学法、Western blot等方法对二陈汤如何通过及Hedgehog通路来干预小鼠肿瘤进行了进一步的研究，为二陈汤抗癌机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株 造模采用雄性C57BL/6小鼠，平均体重16～18 g,6～8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004]。于中国医学科学院基础研究所SPF级动物房进行饲养以及造模取样。Lewis肺癌肿瘤株由中国医学科学院基础研究所提供。

1.2 实验药物 二陈汤由法半夏、陈皮各15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g，乌梅8 g组成(北京中医药大学东方医院提供)。根据人鼠剂量关系换算公式换算灌胃剂量，压缩浓度至生药含量为1.35 g/ml，冷冻保存备用。注射用顺铂10 mg/瓶，批号AA1A7030B。

1.3 实验试剂 GLI-1、SMO单克隆抗体，SHH多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，货号分别为66905-1-Ig、66851-1-Ig、20697-1-AP)；PTCH-1单克隆抗体(英国 Abcam 公司，货号：ab53715)；β-肌动蛋白抗体(Proteintech group，货号：Ag27042)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，货号：PC0020)。

1.4 实验仪器 超净工作台(VD-650)；倒置显微镜(Olympus公司)；5810R 离心机(德国 Eppendorf 公司)；多功能酶标仪(美国Pro-mega公司)；DYCZ-24DH型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；92-14860-00型凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)；石蜡切片机(德国 Leica 公司)。

1.5 实验方法

1.5.1 肺癌模型小鼠的建立及分组给药：取3只荷瘤小鼠，脱颈椎法处死，于超净工作台中剥离瘤组织，取无坏死、生长良好的部分剪碎，制成Lewis细胞悬液，细胞浓度为1×107/ml，接种于小鼠右侧腋窝皮下，0.2 ml/只。接种约5 d后，在小鼠右腋窝皮下可触及绿豆粒大小的肿块，标志造模成功。接种造模成功1 d后按随机数字表法将小鼠分为模型组、中药组、中药联合顺铂组、顺铂组，每组各10只。全部造模完毕后第2天开始给药，模型组予以0.4 ml/20 g的0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续14 d；中药组予0.4 ml/20 g二陈汤灌胃，1次/d，连续14 d；联合组予以3 mg/kg顺铂溶液20 μl/20 g腹腔内注射，1次/d，连用3 d，同时予以二陈汤灌胃；顺铂组予以3 mg/kg顺铂溶液20 μl/20 g腹腔内注射，1次/d，连用3 d，同时予同等0.9%氯化钠溶液灌胃，1次/d，连续14 d。

1.5.2 一般生存状态观察：每日灌胃时观察小鼠一般状态及习性行为情况，对小鼠的生存质量进行评估。

1.5.3 血常规检测：在最后一次灌胃给药24 h后，对小鼠予以摘眼取血，保存至血常规EP管中，采用全自动血细胞分析仪进行血常规的测定。

1.5.4 免疫组化法检测各组Lewis小鼠瘤组织中Hedgehog通路各蛋白的含量：将肿瘤组织进行切片、烘片后再进行脱蜡、水化。将制作好的切片先放入二甲苯Ⅰ浸泡10 min后放入二甲苯Ⅱ10 min脱蜡。然后依次放入不同浓度的乙醇溶液各10 min进行水化，水化完成后再用PBS洗3次，滴加3%H2O2，静置10 min,PBS洗3次。将切片用枸橼酸钠溶液浸泡,再用微波炉修复后予以 PBS洗3次。滴加一抗后，4 ℃过夜。第2天室温复温后滴加二抗,再PBS洗3次。DAB显色，PBS洗3次后复染、脱水用中性树胶封片再进行免疫组化图像分析。

1.5.5 Western blot法检测各组Lewis小鼠瘤组织中SHH、SMO、PTCH-1和Gli-1蛋白的含量：使用蛋白提取试剂盒提取肿瘤组织蛋白，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，冷却上样，凝胶电泳半干法转入 PVDF膜后置于封闭缓冲液(摇床振荡1 h)，分别加入目的蛋白一抗，4 ℃过夜，第2天TBST洗涤后进行二抗孵育，后用ECL显影，进行灰度分析(Bio-Rad，USA)。

1.6 统计学方法 本实验采用SPSS 21.0统计学软件对数据资料进行处理，计量资料以均数±标准差表示。采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；当数据不满足正态分布时则使用非参数检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠一般生存状态 造模前各组小鼠一般状态良好。然而造模后随着各组小鼠腋下种植处出现不同大小的皮下肿块，可观察到各组小鼠出现了不同程度的状态减退现象，如反应迟钝、活动力下降、进食量少等。顺铂组和联合组的小鼠一般情况相较于模型组、中药组要好。肉眼观察可见顺铂组和联合组腋下肿块明显较其他各组小。

2.2 各组小鼠血常规比较 治疗后顺铂组、联合组小鼠WBC、RBC较模型组和中药组降低(P<0.05)，而联合组RBC相较于顺铂组则有所增加，差异无统计学意义(P>0.05)。顺铂组、联合组的血红蛋白含量较顺铂组增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。顺铂组、联合组的PLT较其他两组都有明显的升高(P<0.05)，但两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血常规比较

2.3 二陈汤对Lewis 小鼠瘤组织中SHH、SMO、PTCH-1和Gli-1蛋白表达的影响 与模型组和中药组相比，联合组、顺铂组的Gli-1、SHH蛋白表达均明显降低(P<0.05)。而中药组和联合组的PTCH-1蛋白相较其他两组表达均降低(P<0.05)，提示二陈汤对Hedgehog通路的抑制作用可能与靶点PTCH-1有关。联合组的SMO蛋白表达量为组间最低(P<0.05)，表明二陈汤与化疗药物联合应用能起到更好的阻滞作用。但单纯二陈汤中药治疗或者单纯应用顺铂治疗可能对Hedgehog通路蛋白并不能达到全面覆盖，因此联合顺铂，可以使二陈汤达到增效减毒的效果。对比模型组，联合组、顺铂组Gli-1、PTCH-1、SHH蛋白表达均明显减少(P<0.05)，且与中药组相比，联合组Gli-1、PTCH-1、SMO、SHH蛋白表达水平均明显减少(P<0.05)。见表2 (图1、2)。

表2 各组小鼠肿瘤组织中蛋白表达量比较

图1 二陈汤对小鼠肿瘤组织中SHH通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

目前世界上由于肿瘤而导致患者死亡的恶性疾病中，肺癌患者的病死率排在第一位，每年约有180万人死于肺癌，占因癌症死亡病例总数的13%[3]，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)为肺癌的主要病理分型(占85%)，其中又分为以肺腺癌和肺鳞状细胞癌为主的多个病理亚型，肺腺癌始于产生黏液的肺腺细胞，约占非小细胞肺癌比例的40%[9]。虽然外科手术和内科药物治疗领域的最新进展改善了NSCLC患者的发病率[10-11],然而NSCLC患者的存活率仍旧很低。造成NSCLC患者生存率低的一部分原因是肺癌的早期往往难以检测，在确诊时多数已经存在转移[12]，专家建议需根据患者的年龄和吸烟的包-年数来确定一部分满足条件的烟民进行CT扫描定期筛查，有助于尽早发现病情并进行干预[13]。另一方面，由于晚期NSCLC由多个驱动基因的复杂调控，临床上仍缺乏有效的治疗靶点[12],新的治疗靶点有待进一步探索。

中医古籍中并无肺癌之名，它多以症状出现，它可以是咳嗽、喘证，可以是胸痹，也可以是悬饮，或以病机命名如肺积、息贲。本病病理因素以 “虚、痰、瘀”为主。初期多责之于痰、瘀等实证，而病情发展至中晚期则以气虚、阴虚为主[14]。二陈汤原本出自宋代《太平惠民和剂局方》，方中半夏、橘红皆以陈久者优，而无过燥伤阴之弊得名。在临床上肺癌患者凡是肺脾气虚，兼见痰湿，症见乏力纳少、便溏、气短言疏、痰多色白、恶心呕吐等尤为适宜。明代李中梓云：“脾为生痰之源，肺为储痰之器”，人身之脾胃主水湿的运化，肺脏主通调水道，肺脾协同作用以代谢运输体内的津液，今脾胃运化无力，且肺气不利，则津液内停不行，聚而成痰。故痰饮的治法除温化、淡渗、攻逐、消导外总离不开调理肺脾。方中君药半夏燥湿化痰，和胃降逆；臣以橘红、茯苓之属理气燥湿化痰，健脾淡渗利湿，生姜以降逆止呕；佐以乌梅收敛肺气；使以甘草健脾和中化痰，兼调和诸药。

Hedgehog信号通路是哺乳动物胚胎发育以及胚后细胞生长和分化的主要调节通路之一[15-16]。该通路在成年人类正常个体中基本上是沉默的，有时仅仅参与干细胞的维持以及人体组织的再生和修复[17-18]。然而，Hedgehog信号通路可在包括NSCLC在内的多种肿瘤中均被异常激活，并且与肺癌的临床进展密切相关。经典的Hedgehog信号通路组成包括了配体蛋白SHH，膜受体蛋白PTCH和SMO，核转录因子Gli等。在正常人体环境中，其主要作用为诱导胚胎及干细胞发育，然而在肺癌病理过程中，它的异常激活则是肺癌细胞上皮间质转化过程以及后续侵袭和转移到临床上出现耐药的重要因素。研究发现Hedgehog信号通路不仅可以促进组织中的血管生成，导致VEGF、FGF、CD34等促血管生成因子表达增高[19]，还能抑制NSCLC的上皮间质转化及侵袭,增加了放化疗的敏感性。蒋洁等[20]研究发现中药单体苦参素可通过Hedgehog信号通路来抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭。

本研究结果显示，各组Lewis荷瘤小鼠在腋下移植肿瘤细胞后均能很好的成瘤，相较于对照组，联合组与顺铂组的小鼠瘤体大小、一般精神状态要好。血常规示联合组及顺铂组的小鼠WBC较其他组均有明显的下降，而联合组的血常规与顺铂组比较有所上升，提示二陈汤与顺铂联用对改善铂类药物的不良反应有一定作用。二陈汤的配伍灵活，可以根据病情的需要酌加益气养阴、活血化瘀，以及行气止痛，止呕止吐等对症治疗中药进行加减化裁，可对患者的不良反应、一般生活状况起到改善的作用。 实验中发现联合组和中药组均可以对Hedgehog通路中的Gli-1、SMO、SHH、PTCH-1蛋白的表达有一定的抑制作用。提示其通过抑制Hedgehog通路的信号转导来影响肿瘤的侵袭、转移、耐药等方面是其可能的分子机制之一。