补肺颗粒对哮喘小鼠气道重塑的影响及机制研究

刘 健，王佳丽，曹慧丹，孙 洁

(1.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2.天津中医药大学，天津 300193)

支气管哮喘(以下简称哮喘)作为常见的慢性呼吸道疾病，近年来其患病率在全球有逐年增加的趋势[1]。在我国，近年来哮喘的控制现状虽有进步，但仍不够理想[2]。美国胸科协会在2017年指出，哮喘气道重塑是引发肺功能急速下降、不可逆性气道阻塞以及气道高反应性的主要原因，预防或延缓气道重塑的发生发展，对于保护哮喘患者的肺功能、提高生活质量有着重要的意义[3]。而目前针对气道重塑的治疗却陷入瓶颈[4-5]。

前期研究证实，中药复方补肺颗粒能够有效改善哮喘缓解期患者的气道阻塞并改善小气道通气功能，提高哮喘患者的控制水平，减少哮喘症状急性发作[6-7]，而且能够有效缓解气道炎症[8]。但其对哮喘气道重塑的作用机制尚不明确。本研究旨在研究补肺颗粒对哮喘气道血管生成及气道重塑的影响，从而探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康清洁巴比塞(BALB/C)雌性小鼠80只(SPF 级、6～8周龄、体重18～22 g)。

1.1.2 实验药物：中药复方补肺颗粒由天津中医药大学第二附属医院药剂室提供，主要成分为党参、熟地、山萸肉、赤芍、当归、炙麻黄、陈皮、紫菀、黄芩、桑白皮、甘草，将其制成1 g/ml的水溶液备用。

OVA·Al(OH)3混合液：以10 mg卵清蛋白(OVA)干粉溶于5 ml 0.9%氯化钠溶液中，摇匀。取其中1 ml加入4 ml 0.9%氯化钠溶液，再加入等体积(5 ml)氢氧化铝摇匀。每次使用前需新鲜配制。

1.2.1 哮喘小鼠模型建立：参照文献[9]，以OVA·Al(OH)3混合液腹腔注射致敏及雾化吸入OVA激发的方法制作哮喘小鼠模型，具体制作模型方法如下。小鼠经适应性饲养1周后按随机数字表法分为四组：正常对照组、哮喘模型组、补肺颗粒组、地塞米松组，每组各20只，以苦味酸于不同部位标记。哮喘模型组：小鼠于0、14 d腹腔注射0.1 ml OVA·Al(OH)3混合液，自21 d起予以0.1% OVA溶液雾化吸入，隔日1次，每次30 min，共雾化18次。每次雾化前予以0.9%氯化钠溶液0.1 ml/10 g灌胃。补肺颗粒组：0、14 d腹腔注射及OVA雾化吸入同哮喘模型组，每次雾化前半小时予以补肺颗粒2.84 g/(kg·d)灌胃。地塞米松组：0、14 d腹腔注射及OVA雾化吸入同哮喘模型组，每次雾化前半小时0.5 mg/kg地塞米松灌胃。正常对照组：小鼠于0、14 d腹腔注射0.1 ml 0.9%氯化钠溶液，自21 d起予以0.9%氯化钠溶液雾化吸入，隔日1次，每次30 min，共雾化18次。每次雾化前予以0.9%氯化钠溶液0.1 ml/10 g灌胃。每组小鼠均在末次激发24 h内处死取材。

1.2.2 取材与处理：结扎小鼠右侧支气管，用1 ml注射器抽取0.6 ml预冷无菌PBS注入左肺腔，轻轻按摩左肺，将5 ml注射器接入灌胃针以保证足够的负压抽吸肺泡灌洗液(BALF)。每次灌洗后反复缓慢抽吸灌洗液3次，确保每次回收≥80%。收集最后1次灌洗液至细胞固定液内，以ELISA检查转化生长因子β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、内皮抑素(ES)等的浓度。

取小鼠右肺上中叶组织，以4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、石蜡包埋后行HE染色、Masson染色、AB-PAS染色，光学显微镜下观察肺组织形态结构等病理改变。取右肺下叶组织，以RT-PCR法检测TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES等的mRNA表达。

1.3 观察指标

1.3.1 基本状态：观测小鼠的体重、体温、呼吸、心率及精神状态。

1.3.2 TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES指标：将左侧肺泡灌洗液离心后取上清液，按ELISA试剂盒说明书严格操作，检测标本TGF-β1、TNF-α、VEGF、ES等指标的浓度。

1.3.3 肺组织切片：光镜下观察气道以及肺组织形态结构、气道肺泡损伤、炎症细胞浸润等病理改变。将肺组织连续切片，厚度约4 μm，随后进行HE染色、Masson染色及AB-PAS染色。在200倍光镜下每只小鼠切片随机选取5个完整的细支气管横断面(无软骨且平滑肌完整，无分叉及断裂)，气管最小径/最大径≥0.5，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测定气管基底膜周径(Pbm)、气管壁面积(Wat气管内径线和外膜间面积)，并在有经验的病理科医师指导下测量Masson染色阳性信号面积(wcol)。计算每只气管Wat/Pbm值，取其平均值代表该只动物支气管壁厚度；计算每只气管wcol/Pbm值，取其平均值代表该只动物wcol/Pbm。

股份合作制改革是农村集体产权制度改革的关键所在。据悉，今年农村集体产权制度改革正展开第三批试点。此轮试点将原来的“探索确认集体成员身份”调整为“全面确认集体成员身份”。

1.3.4 RT-PCR：使用 Trizol试剂提取肺组织及支气管中的总RNA后，进行RT-PCR反应。反应条件为：50 ℃预变性2 min，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，56～58 ℃退火加延伸1 min，45个循环。数据采用仪器自带软件分析各样本的Ct值，得出VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α等mRNA的表达水平。引物序列见表1。

1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS 24.0统计学软件分析，所有结果均以均数±标准差表示。两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较行单因素方差分析，不符合正态分布的采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠一般情况比较 正常对照组小鼠活动敏捷，未见异常表现。哮喘模型组、补肺颗粒组及地塞米松组在雾化激发后出现烦躁不安、搔抓身体等表现，部分小鼠出现呼吸急促、站立不稳、腹肌抽搐、二便失禁等表现。上述表现随着激发次数的增加而逐步加重。随着实验的进行，补肺颗粒组及地塞米松组的一般状态逐渐优于哮喘模型组，症状相对较轻且有不同程度的改善。

2.2 各组小鼠气道病理改变 见图1。正常对照组小鼠支气管黏膜上皮、肌层以及肺组织结构完整，支气管腔规则，支气管黏膜上皮整齐，无明显炎症细胞浸润，无明显胶原沉积，不见或仅见少量点状AB-PAS染色阳性信号区域。

图1 各组小鼠气道在不同染色下的病理改变(×200)

哮喘模型组小鼠支气管管腔狭窄，气道壁明显增厚，气道平滑肌层明显增厚，支气管周围及黏膜下有大量炎性细胞浸润，部分管腔内可见黏液栓堵塞；Masson染色下气道上皮下胶原沉积明显增加，可见较厚的致密层；AB-PAS染色下气道上皮内可见较多阳性信号区域。

补肺颗粒组及地塞米松组气管壁及管周炎症细胞浸润、黏膜增厚都较模型组减轻；胶原沉积较正常对照组明显增加，但较哮喘模型组减少；气道上皮内的AB-PAS染色阳性信号区域较哮喘模型组有所减少。

2.3 各组小鼠支气管管壁厚度比较 与哮喘模型组相比，补肺颗粒组及地塞米松组的Wat/Pbm值均有明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。两者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组小鼠胶原纤维厚度比较 与哮喘模型组相比，地塞米松组wcol/Pbm值有下降趋势。补肺颗粒组wcol/Pbm值明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，两者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组小鼠BALF中VEGF、TNF-α、TGF-β1、ES浓度比较 见表2。与哮喘模型组相比，补肺颗粒组VEGF、TNF-α水平均明显降低(P<0.05)，地塞米松组TNF-α水平明显降低(P<0.05)，两者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组小鼠BALF中VEGF、TNF-α、TGF-β1、ES浓度比较

2.6 各组小鼠肺组织中VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α mRNA水平比较 见表3。与哮喘模型组比较，补肺颗粒组VEGF、ES mRNA水平均明显下降(P<0.05)，地塞米松组VEGF、ES mRNA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，两者组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组小鼠肺组织中VEGF、ES、TGF-β1、TNF-α mRNA水平比较

3 讨 论

哮喘气道重塑的主要病理特征包括：上皮下基底膜胶原沉积、上皮损伤、血管新生、黏液腺增生、气道平滑肌增生肥大等[10]。受损上皮细胞释放的生长因子(如TGF-β1、TNF-α等)参与成纤维细胞/肌成纤维细胞合成细胞外基质(ECM)，而这些往往被认为是气道重塑发生的关键细胞[11-12]。研究表明，TGF-β1诱导成纤维细胞增殖[13]，与TNF-α共同促进成纤维细胞向成纤维性和高分泌性肌纤维细胞转化[14]。因此，干预TGF-β1/TNF-α作用的成纤维信号通路对抑制哮喘气道重塑有积极意义[15-16]。在本研究中，同哮喘模型组对比，补肺颗粒组小鼠肺组织中TNF-α、TGF-β1的mRNA水平有下降趋势，BALF中的TNF-α、TGF-β1水平均有降低，其中TNF-α差异有统计学意义，提示补肺颗粒能有效抑制气道壁纤维增生。

气道血管生成是哮喘气道炎症和组织重塑发展和延续中的重要事件，血管数量和大小的增加可导致气道壁增厚，进而导致支气管管腔变窄、气道平滑肌收缩，从而引起气道高反应。血管生成过程中有两组具有相反功能的调节分子参与，VEGF是最主要的正性调节因子[17]，而主要负性内源性因子为ES[18]。因此，调节VEGF及ES水平对于调节气道血管生成有重要意义。在本研究中，同哮喘模型组对比，补肺颗粒组小鼠肺组织中VEGF、ES的mRNA水平均有降低，差异有统计学意义，小鼠BALF中VEGF、ES的水平均有降低，其中VEGF差异有统计学意义。提示补肺颗粒能通过降低VEGF及ES水平，抑制哮喘气道血管增生重塑的病理过程，从而抑制哮喘气道重塑。

中医理论认为，哮喘反复发作，极易损伤气津，痰液更加黏稠难出，滞塞肺络，瘀积不散，出现顽痰胶固，致使肺管狭窄，使无形之气不能宣降，痰瘀互结，气道狭窄，更致津血运行受碍[19]。这种痰瘀气阻的病理特征使病情迁延，与现代医学关于细胞外基质沉积，气道平滑肌增生，血管通透性增加，黏膜水肿，炎性分泌物增多，结果导致气道狭窄、影响通气功能的认知有相通之处[20]。因此哮喘痰瘀互结的病机与现代医学中哮喘气道重塑及血管重塑之间存在必然的相关性。针对这一病理变化研制的补肺颗粒，旨在起到化痰平喘、通络祛瘀之用，能够改善哮喘缓解期患者的气道阻塞，提高哮喘患者的控制水平，减少哮喘症状急性发作。

本研究表明，补肺颗粒对于改善气道管壁及管周炎细胞浸润、抑制黏膜增厚及胶原沉积较都有很好的作用。同时能够有效调节TNF-α、TGF-β1、VEGF、ES等因子的水平。因此，补肺颗粒能有效抑制哮喘小鼠气道重塑，其作用机制可能与干预TGF-β1/TNF-α作用的成纤维信号通路以及调节气道血管生成有关。