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电针颈夹脊穴对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角谷氨酸受体及趋化因子受体表达水平的影响

2022-05-12钟青华林伟弟蒋学余

陕西中医 2022年5期
关键词:夹脊趋化因子谷氨酸

钟青华,杨 松,孟 灵,任 祥,林伟弟,严 森,蒋学余

(1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.岳阳市中医医院,湖南 岳阳 414000)

神经病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是疼痛的一类,这种疼痛是因为周围神经系统或中枢神经系统原发的抑或是继发性的损害、功能障碍导致的,神经病理性疼痛的病理特征主要为自发性的、持续的抑或是多变性的疼痛、痛觉过敏以及痛觉超敏[1-2]。在1996年疼痛就被认为是五大生命体征之一[3]。

颈椎病属于骨病、筋病的范畴,由寒邪收引、湿邪重浊或热邪等导致肌肉筋经弛缓而引起。颈项部的经脉气血运行不畅、筋脉挛缩弛缓失张;年老者肝肾精血亏虚,正气不足,督脉空虚,筋骨失养;长期伏案工作、跌扑损伤,均可导致经脉气血运行不利,气血搏阻筋骨肌肉之间而发病。颈夹脊穴位于督脉之旁开0.5寸,针刺激发经气,可以疏通督脉、足太阳经的经气来调和阴阳,活血通络,脏腑协调,濡养脑髓,扶正祛邪并缓解颈项部的临床症状。研究表明针刺的镇痛效果是显著的,而针刺在外周和中枢水平对神经病理性疼痛的镇痛机制主要为外周机制的外周敏化、离子通道的表达、感觉性去神经支配和交感神经芽生、Aβ纤维出芽、表型的变化;脊髓的中枢敏化、胶质细胞的活化;脊髓上中枢机制;中枢去抑制的脊髓水平与脊髓上水平;促炎细胞因子;痛觉受体表达的上调等方面[4]。

本研究着重脊髓机制的中枢敏化与胶质细胞活化,通过结扎右侧C7脊神经制备神经病理性疼痛模型大鼠,观察电针对模型大鼠脊髓背角谷氨酸受体N-甲基-D-天冬门氨酸(N-methyl-d-aspartate,NMDA)、氨基-3-羧基-5-甲基异唑-4-丙酸(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)及胶质细胞上单核细胞趋化蛋白-1受体(C-C chemokine receptor type 2,CCR2)、趋化因子C-X3-C-基元受体1(C-X3-C-primitive receptor 1,CX3CR1)趋化因子受体表达的影响,探讨电针对神经病理性疼痛模型大鼠镇痛的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康的雄性成年SD大鼠72只,体重200~250 g,饲养地均在湖南中医药大学动物实验中心,动物许可证号:SYXK(沪)2017-0002,饲养温度24~26 ℃,湿度50%~70%。所有大鼠适应性喂养 1 周,采用随机数字表法将大鼠分为六组,每组12只。本研究经过湖南中医药大学动物实验福利伦理会审批并通过,批准号:SLBH201910140006。

1.2 主要试剂与设备 Prime ScriptTMRT reagent Kit(for real time)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(日本宝生物工程公司),焦碳酸乙二酯(DEPC)(西格玛奥德里奇上海贸易公司),TRIzol Reagent (INVITROGEN公司),氯仿、异丙醇、乙醇(国药集团),Richard-Allan ScientificTMNeg-50TM冷冻包埋剂(Thermo),黏附载玻片(世泰),多聚甲醛(国药集团),PBS(吉诺生物),Triton X-100(生工),BSA(Bioshorp),FBS(Gibco),Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG (H+L)、Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG(H+L)、PVP封片液(碧云天)。荧光定量PCR仪96lightcycler(罗氏),低温高速离心机(大龙兴创实验仪器有限公司),-80 ℃冰箱(海尔公司),冰冻切片机、激光共聚焦显微镜(Leica 公司),SDZ-H型电子针疗仪、28号0.5寸不锈钢毫针(华佗牌)。

1.3 模型制备 神经病理性疼痛模型建立:大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉大鼠后,俯卧位,以第2胸椎棘突为标记,以C7为中心,常规备皮消毒后,于大鼠后正中线做一长约3.5 cm的正中切口,暴露并咬除左侧C6/C7关节突,部分咬除左侧C6横突,分离并暴露左侧C6、C7脊神经并结扎C7背根神经节远端神经根,结扎松紧度以倒置显微镜观察神经表面动脉受压但仍有血流通过为宜,然后逐层缝合切口。假手术组的操作与手术组的相同,但不结扎C7背根神经节远端神经根。

神经病理性疼痛大鼠模型制备同时结合鞘内置管:用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射大鼠麻醉,沿大鼠颈后中线纵向切开皮肤和皮下筋膜后,向两边钝性分离肌肉,再用咬骨钳去除颈椎棘突,并且咬开颈椎椎板,看到清亮液体流出时,撕开硬脊膜,然后经过小脑延髓池,将PE-10管插入蛛网膜下腔到L5-L6节段处,为防止术中血凝块堵塞管口,封闭PE-10管外口,需要用微量注射器缓慢推入10 μl的0.9%氯化钠溶液,并将露出在皮外的PE-10管固定在颈部皮肤,最后再逐层缝合切口,并用青霉素腹腔注射来预防感染,手术后观察2~3 d,并且剔除C7范围神经功能损伤者。本实验所有手术过程均由同一人操作,以保证组间平衡和可比性。

1.4 干预方法 空白组:正常的SD大鼠并喂饲标准饲料。模型组:复制大鼠模型并结合鞘内置管,喂饲标准饲料,术后第7天开始,同时间点按照电针组进行绑缚。假手术组:喂饲标准饲料,同模型组相同的手术过程,鞘内置管但不结扎神经,术后第7天开始,同时间点按照电针组进行绑缚。电针组:复制大鼠模型并结合鞘内置管,喂饲标准饲料,术后第7天开始,每天将大鼠俯卧位绑缚于鼠板上,给予电针颈夹脊穴干预(针柄连接华佗牌SDZ-H型电子针疗仪,调整电针波形为疏密波,密波频率50 Hz,疏波频率10 Hz,早上9:00开始电针治疗),每次 20 min,1次/d,连续干预14 d。根据中国针灸学会实验针灸委员会制定的动物针灸穴位图谱进行穴位定位,双侧的C6、C7夹脊穴:位于大鼠颈椎棘突间旁开约 0.5 cm处。针具及手法:选用华佗牌28号0.5寸不锈钢毫针,直刺约0.3~0.6 cm,并予以轻捻转提插行针。L-α-氨基乙二酸(L-α-aminoadipate,LAA)组:复制大鼠模型并鞘内置管,喂饲标准饲料,术后第7天开始每天鞘内注射胶质细胞抑制剂LAA,5 nmol/次,1次/d,持续14 d,同时按照电针组进行绑缚。LAA+电针组:复制大鼠模型并鞘内置管,喂饲标准饲料,术后第7天开始每天鞘内注射LAA,5 nmol/次,1次/d,持续14 d,同时间节点按照电针组进行电针颈夹脊穴治疗。

1.5 标本采集 所有的动物实验结束后,对大鼠实施功能学指标检测,并称取大鼠体重,禁食不禁水24 h,大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后,剪开胸腔并暴露心脏,从心尖插入灌注针直至左心室后用止血钳固定针尖,并剪开右心耳,形成灌注液排出管道,从左心室快速灌注37 ℃ 0.9%氯化钠溶液,直到从右心耳流出的液体为无色、大鼠肝脏色淡、肠管肿胀时,需要停止灌流。然后将灌流器的导管小心移至4%多聚甲醛中,此时需要注意不要产生气泡,再进行灌流。如果看到大鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。灌流大约5 min,灌流液用量约150 ml左右结束。取出脊髓腰段膨隆部,在上肢近心端向下5 cm处为中点,将此点上下各 3 cm椎骨剪断,再剥离肌肉,咬平棘突,用弯剪把骨质最薄的棘突旁骨片剪开,再用细针轻轻把神经分离剪断,用止血钳夹住两旁椎骨,并夹碎。取出C7处上下2 cm的脊髓节段用于相关指标检测。

1.6 检测指标与方法

1.6.1 采用Real-time PCR检测大鼠脊髓背角NMDA、AMPA受体的表达:Total RNA的提取和鉴定方法为,取30~50 mg组织样本,加入1 ml Trizol,60 Hz,30 s,0 Hz,10 s匀浆3次,室温裂解5 min;加入1/5 Trizol体积的氯仿,剧烈振荡15 s,待溶液充分乳化无分相现象,在室温静置5 min;12000 g,4 ℃离心15 min;小心取出离心管,吸取上清液转移至另一RNase free EP管中;加入等体积的异丙醇,上下颠倒充分混匀后,在室温静置10 min;12000 g,4 ℃离心10 min,弃去上清;75%乙醇1 ml洗涤,12000 g,4 ℃离心5 min,弃去乙醇;室温干燥2~3 min,加入20 μl灭菌DEPC水溶解沉淀,用手指尖轻弹EP管底部至完全溶解。测定RNA样品浓度。OD260/OD280=1.91,提取的RNA纯度高,无蛋白质和DNA的残余。

cDNA合成:0.2 ml的RNase free EP管中配制混合液,冰上操作。37 ℃,15 min,85 ℃,5 s,4 ℃,60 min得到的cDNA加入30 μl的ddH2O稀释备用。可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或PCR扩增,-20 ℃保存。PCR扩增时cDNA的推荐最大使用量为1 μl。

定量PCR反应:PCR管中配制PCR反应混合液,冰上操作。首先混匀,每个样品做3个重复对照。然后设定两步法PCR扩增标准程序:第一步为预变性,Reps:1,95 ℃,30 s;第二步为PCR反应,Reps:40,95 ℃,5 s,60 ℃,30~34 s;Dissociation Stage,上机扩增检测,最后利用2-△△Ct法计算相对表达量。

1.6.2 采用免疫荧光法检测各组大鼠脊髓背角CXC3R1、CCR2的表达:用组化笔在玻片上圈起组织;用PBS浸润组织;4%多聚甲醛处理(室温)10 min;PBS漂洗,5 min,3遍;0.5%Txiton X-100处理(室温)5 min;TBST漂洗,5 min,3遍;封闭(室温)1 h;孵育一抗(用0.1% BSA/TBST配)4 ℃孵育过夜;0.1%BSA/TBST漂洗,5 min,3遍;孵育荧光二抗(用含0.1%BSA的TBST配)RT孵育1~2 h;0.1%BSA/TBST漂洗,5 min,3遍;DAPI,5 min;PBS漂洗,5 min,3遍;为了玻片保存时间更久,用带抗淬灭剂的封片剂封片,镜下观察并且在荧光显微镜下拍照。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0统计学软件进行分析,计量资料采用均数±标准差描述,组间对比采用单因素方差分析,两两比较采用LSD比较,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脊髓背角NMDA、AMPA表达比较 假手术组与空白组相比较,大鼠脊髓背角的NMDA、AMPA表达差异无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组脊髓背角NMDA、AMPA表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);电针组、LAA组、LAA+电针组大鼠的脊髓背角NMDA、AMPA表达较模型组表达均降低(P<0.05);与电针组相比,LAA组、LAA+电针组大鼠的脊髓背角NMDA、AMPA表达均降低(P<0.05);相较于LAA组,LAA+电针组的大鼠脊髓背角NMDA、AMPA表达均下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠脊髓背角NMDA、AMPA表达比较

2.2 各组大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达比较 假手术组与空白组相比,大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达差异均无统计学意义(P>0.05);与假手术组相比,模型组脊髓背角CCR2、CX3CR1表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);电针组、LAA组、LAA+电针组大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达较模型组均降低(P<0.05);与电针组大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达相比,LAA组、LAA+电针组均降低(P<0.05);相较于LAA组,LAA+电针组大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达均下降(P<0.05)。见表2(图1、2)。

表2 各组大鼠脊髓背角CCR2、CX3CR1表达比较

图1 各组大鼠脊髓背角CCR2免疫荧光图(50 μm)

图2 各组大鼠脊髓背角CX3CR1免疫荧光图(50 μm)

3 讨 论

《足臂十一脉灸经》第一次描述了“夹脊”,而后《素问·刺疟》:“十二疟者……又刺项以下夹脊者必已”;《素问·缀刺论》:“邪客于手足太阳络……立己。”《太素》第二十三卷《量缀剌》:“刺之从项始数脊椎……刺之旁三痏立己”;杨上善对其补充:“脊有廿一椎……各剌三痏也”。最早说明了夹脊穴大约分寸与距离的是《后汉书》所载的《华伦别传》[5]。夹脊穴有狭义、广义之分,狭义的夹脊穴有34穴,范围是第一胸椎到第五腰椎;广义的夹脊穴有56穴,除了第一胸椎到第五腰椎段,还包含了颈椎段与八髎穴。颈夹脊穴即为C1~C7,脊正中旁开0.5寸,共14穴。颈椎病属于骨病、筋病的范畴。主要因为寒邪收引或湿邪重浊,亦或是热邪等导致肌肉筋经弛缓而引起。颈项部的经脉气血运行不畅、筋脉挛缩弛缓失张;年老者肝肾精血亏虚,正气不足,督脉空虚,筋骨失养;长期伏案工作、跌扑损伤,均可导致经脉气血运行不利,气血搏阻筋骨肌肉之间而发病。而颈夹脊穴位于督脉之旁开0.5寸,当针刺后,经气得以激发,可以疏通督脉、足太阳经的经气来调和阴阳,活血通络,脏腑协调,濡养脑髓,扶正祛邪并缓解颈项部的临床症状[6-9]。当针刺颈夹脊穴的时候,针尖可以直刺至颈椎横突后结节以及小关节囊,此时会激发经气到达病变的部位,这就符合“经脉所过,主治所及”的针刺治疗原则。

脊髓背角星形胶质细胞和小胶质细胞的激活是由于炎症、外周神经损伤、骨癌、脊神经结扎或截断、脊髓外伤等诸多致病因素所致[10]。脊髓背角的胶质细胞活化后会释放一系列的疼痛增强物质,并传递痛觉伤害,介导痛觉过敏[11]。研究表明电针通过抑制颈部肌肉痉挛、减轻炎性物质的浸润、促进循环、消除局部血肿、升高痛阈值、抑制痛觉信息的传导、修复损伤的神经根等这一系列反应发挥作用的[12-13]。电针通过再生修复损伤脊髓神经元,恢复脊髓神经元的功能,阻止星形胶质细胞持续性、反馈性地增生,最终可以阻碍胶质瘢痕的生成[14-15];并抑制脊髓背角神经元突触可塑性变化的形成,以减弱脊髓背角神经元的敏感化,最终达到镇痛的作用[16]。电针通过抑制一氧化氮表达与一氧化氮合酶释放而抑制带状疱疹后遗神经痛大鼠的脑星形胶质细胞的激活[17];或抑制脊髓损伤区AMPA受体亚基GluR1的表达,进而促使急性糖尿病模型大鼠脊髓前角损伤的神经修复,进而增加脊髓谷氨酸转运体蛋白质的表达[18-19]。电针可通过抑制脊髓内趋化因子CX3CL1表达,抑制脊髓组织中促炎性因子肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-6表达[20-21],并调节相关信号通路,改善完全弗氏佐剂所致炎性痛症状,抑制脊髓的FKN表达,最后发挥镇痛的效应[22-23]。电针可以抑制p38丝裂原活化蛋白激酶、转录激活子3信号通路与RGs内卫星胶质细胞活性,减少促炎细胞因子的释放,降低卫星胶质细胞之间的信息交流,最终达到缓解大鼠颈部切口痛的目的[24]。诸多研究表明可以运用电针并联合应用胶质细胞拮抗剂来达到增强电针镇痛的效应[25-26]。

NP在外周敏化、中枢敏化两个作用方面主要是通过神经胶质细胞与神经元之间的相互作用,趋化因子、生长因子、促炎细胞因子等表达,来产生疼痛并且维持疼痛的发生的。中枢敏化是神经病理性疼痛发生与维持的关键机制之一,神经病理性疼痛的基础兴奋性氨基酸是中枢神经系统中兴奋性神经递质,包括谷氨酸和天门冬氨酸,当周围神经损伤后,可以激活脊髓兴奋性谷氨酸受体。NMDA和AMPA受体是谷氨酸的离子型受体。兴奋性氨基酸在中枢敏化和脊髓传导转化方面起到关键作用,脊髓传入神经末梢后释放谷氨酸,继而激活谷氨酸释放NMDA受体和非NMDA受体,当NMDA受体激活,可以促使神经元持续性兴奋,并使得神经元的突触活动频率增加,自发或诱发神经元放电增多、感受相应地扩大[27-28]。谷氨酸在静息电位下主要存在于神经末梢的突触囊泡内,而谷氨酸受体通道因为与镁离子进行结合而被阻滞;当伤害性刺激出入时,神经末梢去极化时释放到突触间隙,作用于突触后膜的特异性受体,引起钙离子内流,并触发细胞内激活蛋白激酶A、蛋白激酶C等Ca敏感性信号的级联反应,然后促进传递伤害性信息介质的生成,并激活神经型一氧化氮合酶系统和产生氧化应激反应,最终诱导脊髓中枢神经通路的兴奋信号激活[29-31]。

趋化因子及其受体对多种细胞内激酶的激活,并进一步磷酸化离子通道和受体来增强神经元的兴奋性或突触传递,并激活相应的G蛋白偶联受体,激活胞内信号通路参与细胞迁移、增殖及炎症结构相似的小分子分泌蛋白[32]。外周及中枢神经系统内多种趋化因子及其受体,通过神经元和非神经元细胞之间的相互作用、增强神经炎症。趋化因子有CC、CXC、C以及CX3C这四个亚家族[33],趋化因子Fractalkine(CX3CL1)简称FNK,归属于四个亚家族的CX3C亚家族,是小胶质细胞在中枢神经系统中活化的调节因子。趋化因子的受体有CCR、CXCR、CX3CR以及XCR这四种,七次跨膜的G蛋白偶联受体CX3CR1主要表达在外周血白细胞、中枢神经系统的小胶质细胞,CX3CL1在小胶质细胞中特殊的受体表达信号则是CX3CR。全长的CX3CL1表达在初级传入末梢以及脊髓神经元上,而剪切后的CX3CL1作用于它的唯一受体,小胶质细胞上CX3CR1。CC亚族趋化因子配体21(CCL21)表达于神经元,作用于小胶质细胞上的CXCR3受体[34]。CC亚族趋化因子配体2(CCL2)属于CC趋化因子家族,CCL2能够识别多个受体,CCR2也可以被多个趋化因子识别,但是在小鼠组织内,对比结合与CCL7的结合,CCR2特异性结合CCL2的亲和力是其10倍[35]。CCL2从初级神经传入末梢神经后,释放在作用于小胶质细胞上的CCR2受体后,在胞内产生p38磷酸化,促进小胶质细胞激活,然后释放促炎性细胞因子和生长因子,最终诱发神经病理性疼痛的发生;而促炎性细胞因子正反馈作用于小胶质细胞释放CCL2;CCL2也在星形胶质细胞表达并释放,作用于神经元上的CCR2受体[36],使细胞内ERK磷酸化,并激活星形胶质细胞,促进促炎因子的合成及其释放,促炎因子又反作用促进CCL2的分泌。肿瘤坏死因子-α可以刺激其与应激活化蛋白激酶(SAPK)这一通路,刺激星形胶质细胞再次释放 CCL2,CCL2和炎性因子作用于神经元,通过增加兴奋性突触传递使中枢敏化,易化神经病理性疼痛;CCR2的激活同时也可使p-ERK活化,促使神经元释放CCL2,并且参与神经病理性疼痛。趋化因子也参与调节谷氨酸NMDA受体、AMPA受体的功能。CCL2与神经元上的CCR2结合,参与了突触前神经末梢递质释放和谷氨酸受体活性的调节,导致兴奋性突触传递增强活化NMDA和AMPA受体[37];同时也可直接作用在 GABAA受体,抑制GABA电流。综上,本研究选取谷氨酸受体NMDA、AMPA,及胶质细胞活化受体CCR2、CX3CR1作为研究对象,探究电针对其影响及作用机制。

本研究通过神经病理性疼痛大鼠的建立,探究电针颈夹脊穴对此模型大鼠谷氨酸受体NMDA、AMPA及胶质细胞活化受体CCR2、CX3CR1的影响发现,电针组与LAA组相比NMDA差异无统计学意义,电针组与LAA组相比AMPA有所降低,说明CCL2/ CCR2、CX3CL1/CX3CR1参与了谷氨酸受体活性的调节,且LAA抑制CCL2、CX3CL1与神经元上的CCR2、CX3CR1结合;电针与LAA抑制谷氨酸受体NMDA表达无差异可能受到实验差异的影响,而电针可抑制谷氨酸受体NMDA、AMPA的表达,其作用机制与LAA类似,但仍然需要进一步实验探究。LAA+电针组较LAA组、电针组的NMDA、AMPA活化水平显著降低,说明LAA与电针具有协同性,并抑制NMDA、AMPA的活化,但LAA与电针之间的相互作用仍需进一步研究探讨。电针组、LAA组、LAA+电针组较模型组CCR2、CXCR1表达量均降低,LAA组、LAA+电针组与电针组相比CCR2、CXCR1表达量均降低,LAA+电针组相较于LAA组的CCR2、CXCR1表达量下降,以上进一步说明电针抑制CCR2、CXCR1的活化,阻止CCL2、CX3CL1与其受体CCR2、CX3CR1的结合。

综上所述,电针颈夹脊穴可抑制神经病理性疼痛大鼠CCR2、CX3CR1活化,影响CCL2、CX3CL1及其受体CCR2、CX3CR1的结合,并降低谷氨酸受体NMDA、AMPA活化,抑制了胶质细胞的活化及中枢敏化,进而减少促炎性细胞因子和生长因子释放,减少神经病理性疼痛发生。

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