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微RNA-21对坐骨神经损伤大鼠模型神经再生的促进作用

2022-05-12艾克热木江木合热木阿不都乃比艾力马赛

骨科临床与研究杂志 2022年3期
关键词:腓肠肌肌纤维传导

艾克热木江·木合热木 阿不都乃比·艾力 马赛

周围神经损伤是创伤骨科常见疾病,约5%创伤患者伴有周围神经损伤[1-2]。周围神经损伤导致的肢体功能缺损会严重影响患者的生活能力和工作能力,给患者及其家庭带来巨大的痛苦和经济负担[3]。周围神经损伤的修复一直是外科医生面临的挑战。目前治疗长段神经缺损的金标准是自体神经移植。然而,由于该手术时间长,同时存在供体有限与可能导致供区并发症等缺陷,其应用受到限制。随着生物可降解材料相关研究的发展与进步,各种神经导管已可用于神经缺损的桥接。但是,神经导管在神经损伤后支持轴突再生方面的潜力有限,大多数中空导管只能在很短的距离内支持轴突再生[4-5]。近年研究结果表明,神经损伤触发的细胞反应受到多种微RNA相关信号通路的调控[6]。微RNA是一种长度为22~23个核苷酸的单链内源性非编码RNA,在转录后水平调节真核基因表达,在细胞的发育、分化、增殖、凋亡和癌变等多种生理和病理过程中发挥着重要作用,被认为是多种药物干预的潜在靶点[7-10]。本研究利用大鼠模型研究微RNA-21对坐骨神经再生的促进作用,以验证微RNA-21可能加速轴突再生,促进周围神经损伤后功能恢复这一假说。

资料与方法

一、资料

依据miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)中检索到的大鼠微RNA-21前体序列(UGUACCACCUUGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACAGCAGUCGAUGGGCUGUCUGACAUUUUGGUAUC),购买具有以下微RNA序列的试剂:Rat-mir-21-sense:5-TGTACCACCTTGGGGTACTTATCAGACTGATGTGTGTGTGTGATCTCATGGCAAGAGAGAGAGTCGATGTGTCTGTCTGTTTTTGT-3,Anti-sense:5-CTAGACAAAAAAGATACCAATGTCAGACACCATCGACTGCTGTTGCCATGAGATTCAAGTCACAGTCATCGATAAGCTACCACAGCAAGAGTGTACA-3(上海三工生物科技有限公司,中国)。选取6~8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠50只(由新疆医科大学动物中心提供),体质量(220.3±20.5)(200~250)g。依据动物模型的治疗方法将大鼠随机分为3组:微RNA-21组20只大鼠,体质量(223.5±18.7 g)(200~250)g;绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)组20只大鼠,体质量(220.3±21.6)(200~250)g;正常组10只大鼠,体质量(215.0±21.6 )(200~250)g。购买胶原导管(北京天心府医疗器械有限公司,中国)若干。本研究经新疆医科大学第六附属医院伦理委员会审核批准。

二、方法

1. 含有微RNA-21编码序列载体的制备:(1)将微RNA-21序列克隆到质粒载体:编码微RNA-21的质粒通过由40 μl核酸酶游离水、20 μl DNA寡核苷酸退火缓冲液(5×)、20 μl DNA寡核苷酸(50 μmol)和20 μl反义DNA寡核苷酸(50 μmol)组成的缓冲液构建。其构建的热循环条件为:95 ℃下2 min,降温速度为1 ℃/90 s,直至温度降到25 ℃后保存于4 ℃。将293T细胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基(Invitrogen公司,美国)中培养。293T细胞在浓度为80%时被H1和辅助质粒Pcmv delta R8.9转染。培养3 d后,收集293T细胞并进行病毒纯化。通过超速离心浓缩载体,并使用滴度为(1×109)IU/ml的载体进行动物实验。

2.动物实验:术前采用标准啮齿动物食物和无限量水饲养大鼠1周。(1)大鼠坐骨神经损伤模型的制作:采用10%水合氯醛麻醉,将大鼠以俯卧位置于手术台上。暴露大鼠右侧坐骨神经,对微RNA-21组和GPE组大鼠以微型剪刀制作6 mm神经缺损,并立即使用10 mm长的胶原导管进行插管修复。将神经残端插入导管2 mm,并用9-0微缝线将其缝合到导管上,使近端和远端残端之间保持6 mm距离。对GPE组大鼠,将3 μl控制载体注射到用于桥接神经缺损的神经导管中。对微RNA-21组大鼠,将3 μl含有微RNA-21编码序列的载体注射到用于桥接神经缺损的神经导管中。分层缝合关闭切口。对正常组大鼠暴露坐骨神经后不做处理,直接关闭切口。术后在与术前相同条件下饲养动物8周。

3.神经再生效果评价:(1)坐骨神经功能指数(sciatic nerve function index,SFI)评估:取每组各5只大鼠。将大鼠后脚浸于墨水中,使大鼠穿过一个底部铺有40 cm×8 cm白纸的隧道,将脚印记录在白纸上。分别对正常足(N)和实验足(E)的脚印进行测量和评价,包括第3趾至足跟的足印长度(print length,PL)、第1趾至第5趾的足印宽度(toe spread,TS)和第2趾至第4趾的中趾宽度(intermediary toe spread, ITS)。采用Varejão等[12]描述的公式进行计算:SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EITS-NITS)/NITS]-8。正常坐骨神经的SFI为0,完全神经功能障碍的坐骨神经SFI为-100 。(2)坐骨神经传导速度评价:将完成SFI测试的大鼠以0.3 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉。暴露正常和手术部位的坐骨神经,将刺激电极置于缝合线的近端,传导速度记录电极穿入腓肠肌,电刺激参数为1.0 mV,1 ms和1.0 kHz,测量坐骨神经传导速度。(3)腓肠肌质量评估:取每组各5只大鼠。行腹腔注射0.3 ml/100 g 10%水合氯醛麻醉。切取双侧腓肠肌,采用电子天平称量,计算右侧与左侧腓肠肌质量比值。(4)组织学评估:称取腓肠肌质量后,将其置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h,置于30%蔗糖磷酸盐缓冲液中24 h。采用冷冻切片机垂直切割为20 μm厚的组织切片4片,分别进行HE和AchE染色,于光学显微镜下观察。①HE染色:将玻片于苏木精溶液中染色5 min,使细胞核变暗,洗涤10 min,于0.5%曙红乙酸溶液(1∶100)中培养10 min,使肌纤维变红,于二次蒸馏水中洗涤3 min,以去除多余的伊红,分别于70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇和二甲苯中排水1 min,30 s,30 s和30 s。用1~2滴二甲苯基安装介质安装载玻片,并用盖玻片覆盖,并将载玻片储存在室温下,直至显微镜下观察。②AchE染色:将载玻片置于培养液(碘硫代葡萄糖苷乙酰胆碱5 mg,0.1 mol/l醋酸盐缓冲液6.5 ml,0.1 mol/l柠檬酸三钠0.5 ml,0.03 mol/l硫酸铜1 ml,蒸馏水1 ml,0.005 mol/l铁氰化钾1 ml)中,37℃下培养4 h,脱水,以甘油明胶密封。

结 果

术后8周,所有大鼠均存活并接受了效果评价。

一、SFI评价

两组大鼠SFI分别为微RNA-21组-47.7±2.1和GFP组-59.4±3.7,差异有统计学意义(P<0.001)。

二、坐骨神经传导速度

3组大鼠坐骨神经传导速度分别为正常组(30.2±1.6)m/s,微RNA-21组(16.5±1.3) m/s,GFP组(10.5±1.4) m/s,组间差异均有统计学意义(均P<0.001)(图1)。

图1 3组大鼠坐骨神经传导速度其及比较 A GFP组大鼠坐骨神经传导波形图 B 微RNA-21组大鼠坐骨神经传导波形图 C 正常组大鼠坐骨神经传导波形图 D 3组大鼠坐骨神经传导速度的比较 图2 微RNA-21组与GFP组大鼠腓肠肌组织光学显微镜下表现 A 微RNA-21组见肌纤维呈多边形,周围有细胞核、较完整的肌膜和肌浆(HE,标尺=100 μm) B GFP组见肌纤维染色较微RNA组浅,形态不规则,细胞核少,肌纤维萎缩,分布不均(HE,标尺=100 μm) C 微RNA-21组见成排的深棕色细粒亚铁氰化铜沉积物,椭圆形,直径较大(AchE,标尺=100 μm) D GFP组见亚铁氰化铜沉积物颜色稍浅,细胞较微RNA-21组小(AchE,标尺=100 μm)

三、腓肠肌质量评价

两组大鼠伤侧与健侧腓肠肌质量比分别为微RNA-21组0.82±0.02,GFP组0.55±0.06,差异有统计学意义(P<0.001)。

四、组织学评价

微RNA-21组大鼠腓肠肌HE染色组织切片可见肌纤维呈多边形,周围有细胞核、完整的肌膜和肌浆;GFP组大鼠腓肠肌HE染色组织切片可见肌纤维染色较实验组浅,形态不规则,细胞核少,肌纤维萎缩,分布不均(图2A,B)。微RNA-21组大鼠腓肠肌AchE染色组织切片可见成排的深棕色细粒亚铁氰化铜沉积物,椭圆形,直径较大,为20~40 μm;GFP组大鼠腓肠肌AchE染色组织切片可见亚铁氰化铜沉积物颜色稍浅,并且较微RNA-21组小,颗粒数量较微RNA-21组明显减少。两组均可见肌纤维萎缩(图2C,D)。

讨 论

目前治疗周围神经损伤的金标准是自体神经移植。自体神经移植不会引发免疫排斥反应,通常可以获得良好的神经功能恢复。然而,自体神经移植也存在手术时间长、供体神经来源缺乏和导致供体部位神经功能损伤等缺陷,这些局限性使其无法在大量患者中得到应用[13-15]。神经导管可有无限的供应,可以避免供体部位神经功能损伤的发生,但因不能为再生神经提供神经营养支持而无法支持长段神经缺损的轴突再生。据此假设,如果将更多的神经营养支持输送到神经导管中,可能加速轴突的再生[16-17]。

神经元的远端结构和功能区域,如轴突、突触前神经末梢和树突,包含高度多样的微RNA群体。这些微RNA在神经细胞极性的发育和维持以及突触的可塑性、再生和修复中起着特别重要的作用[18-19]。在最近一项研究中,Strickland等[20]使用微阵列方法分析坐骨神经被切断后的变化。其研究结果表明,在小鼠和大鼠背根神经节中,L4和L5背根神经节中的微RNA-21表达分别增加了7倍和3倍,且呈现微RNA-21过度表达的神经元神经轴突生长显著增加。

本研究尝试观察在大鼠体内微RNA-21是否能加速坐骨神经轴突生长,并促进坐骨神经损伤后的功能恢复。将含有微RNA-21编码序列的神经导管载体组合应用于桥接大鼠坐骨神经缺损,并通过对坐骨神经的功能评价、肌电生理评价以及组织病理学观察对效果进行评估。结果表明,应用了含有微RNA-21编码序列载体的大鼠较应用对照载体GFP的大鼠获得了更好的坐骨神经轴突生长和功能恢复。虽然目前的研究设计较为简单,但这一结果证明微RNA可以促进周围神经损伤期间的轴突再生,揭示了上调微RNA-21表达在神经缺损治疗中的重要作用,为临床周围神经损伤联合治疗的进一步研究提供了证据。微RNA-21促进神经生长的机制尚需进一步深入研究。

综上所述,微RNA-21逆行转染神经元可显著促进大鼠坐骨神经损伤后的再生和功能恢复。含有微RNA-21编码序列的慢病毒载体的应用可能成为未来临床试验中周围神经损伤治疗的一种新方法。

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