母体孕期维生素D缺乏对胎盘甾体激素合成的影响

付 林，陈远华，徐德祥

胎儿宫内生长受限(fetal intrauterine growth restriction, IUGR) 是指受病理因素影响，胎儿出生未能达到其遗传决定的全部生长潜能[1]。在美国和欧洲，IUGR的发生率为5%～15%，而在中国IUGR的发生率为6%～10%[2-3]。IUGR不仅增加了死胎发生风险，同时也是诱发围产期胎儿高发病率和死亡率的主要原因[4]。此外，IUGR还会增加成年期慢性疾病的风险，研究[5-6]表明，IUGR胎儿在成年期以后易患Ⅱ型糖尿病、中心性肥胖、心血管疾病、代谢性疾病以及神经发育受损等。

维生素D缺乏(vitamin D deficiency, VDD)，指血清中25-(OH)-D的水平低于20 ng/ml，近年来母体孕期维生素D缺乏与不良妊娠结局的关系受到越来越多的关注，流行病学研究[7-9]表明母体孕期维生素D缺乏增加了死胎、流产以及早产的发生风险，但是维生素D缺乏诱发IUGR具体机制不清楚。因此，该研究旨在通过低维生素D饲料喂养构建VDD诱发IUGR孕鼠模型，并从甾体激素合成方面探讨VDD诱发IUGR的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级CD-1系成年雌鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2017-0007。4周龄雌鼠体质量18～20 g，饲养在恒温恒湿鼠房中，自由进食和饮水，保持恒定的昼夜节律。动物实验遵从安徽医科大学实验动物科学协会和实验动物科学中心的管理章程，符合动物伦理学的规定。

1.1.2药物与试剂 雌激素和孕激素检测试剂盒购于北京美正生物科技有限公司。核因子E2相关因子(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2；货号：ab62352)、NADPH氧化酶2 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX-2；货号：ab80508)、细胞色素P450家族成员11A1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1；货号：ab67355)和β-actin (货号: ab179467)一抗购于美国Abcam公司；NADPH氧化酶2 (NOX-4；货号：D21F6)、血红素氧合酶1 (heme oxygenase-1，HO-1；货号：E9H3A)和血红素氧合酶2 (HO-2；货号：D9J9U)一抗均购于美国Cell Signaling Technology公司；芳香化酶p450 (aromatase cytochrome P450，CYP19；货号：SC14245)、3β-羟基类固醇脱氢酶 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD2；货号：SC28206)和3-硝基酪氨酸 (3-nitrotyrosine，3-NT；货号：SC32757)一抗购于美国Santa Cruz公司。RNA提取试剂盒由美国Promega公司提供，逆转录试剂由瑞士Roche公司提供，PVDF膜由美国Millipore公司提供，ECL显色液由美国Advansta公司提供，免疫组化试剂盒由北京中山金桥生物技术有限公司提供。其他常规试剂均购自美国Abcam公司。

1.1.3仪器 Fine Do X6全自动化学发光分析系统(上海天能科技有限公司)，LightCycler®480定量PCR仪 (美国Roche公司)，Senergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)，Universal32R低温高速离心机(德国Hettich科学仪器公司)，UV-1200型紫外可见分光光度计(中国上海翱艺有限公司)，光学显微镜和DP71成像系统(日本Olympus公司)。

1.2 动物模型的制备小鼠适应性喂养1周以后，随机均分成对照组(CTRL组)和维生素D缺乏组(VDD组)。CTRL组小鼠喂养标准饲料(维生素D含量大于800 IU/kg)，VDD组小鼠饲养在无紫外光的环境中，并喂以低维生素D饲料(维生素D含量小于25 IU/kg)。正常饲料和低维生素D饲料购于北京科奥协力有限公司。饲养5周以后，于晚上9:30按照4只雌鼠与2只正常雄鼠合笼交配，次日早上7:30检查阴栓，以阴道口查到黄色栓状固体分泌物视为交配成功。查到阴栓的天数记为妊娠第1天，在妊娠第16天剖杀部分孕鼠，取母鼠血液检测血清甾体激素水平，留取胎盘进行蛋白免疫印迹(Western blot)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学检测；在妊娠第19天剖杀剩余孕鼠，取胎血检测血清25-(OH)-D水平，统计活胎、死胎以及吸收胎数，称取胎鼠和胎盘重量，量取胎鼠身长和胎盘直径。

1.3 胎盘总蛋白的提取及Western blot实验剪取3/4个胎盘组织到含有500 μl蛋白裂解液的电动匀浆器中，冰上快速匀浆30 s，结束后转移到1.5 ml离心管中，插入冰盒中静置12 min，然后在4 ℃离心机中15 000 r/min离心10 min，然后吸取上清液300 μl至新的EP管中，冰盒上继续静置5 min，然后4 ℃离心机中10 000 r/min继续离心5 min，吸取上清液250 μl，煮沸变性10 min，所得即为小鼠胎盘组织总蛋白，分装于-80 ℃超低温冰箱中保存。接下来进行SDS-PAGE电泳，取下PVDF膜，清洗干净，牛奶封闭，孵育一抗(1 ∶2 000稀释)和二抗(1 ∶10 000稀释)[10]，PBS漂洗干净，加入ECL发光液，然后自动发光显影，拍照并分析目的条带灰度值，计算目的蛋白表达量。

1.4 放射免疫分析法用放射免疫法检测血清中孕激素、雌激素以及25-(OH)-D的水平。试剂盒于室温中复温30 min，稀释标准品，构建标准曲线。然后在玻璃管中加入500 μl乙腈、标准品、质控和待测样品。剧烈震荡20 s，室温下3 000 r/min离心10 min，吸取上清液50 μl至新的玻璃管中，加入125I 放射试剂，然后加入抗体，震荡混匀，孵育30 min后，加入二抗复合物，继续孵育30 min，然后于放射免疫分析仪中检测其放射强度，根据已知的标准曲线换算血清中雌激素、孕激素和25-(OH)-D的水平。

1.5 免疫组织化学法取部分小鼠胎盘组织，将其固定于4%多聚甲醛溶液中，期间不停晃动样品管，固定24 h后液体石蜡包埋胎盘组织，切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇溶液(从高到低)水化，PBS洗片。TritonX-100通透液(含有双氧水)通透50 min，然后在微波炉中加热柠檬酸钠溶液进行抗原修复。抗原修复完成后，进行冷却。然后加入血清，湿盒中封闭2 h，吸干血清，无需清洗，直接加入一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜，回收一抗，加入二抗工作液，37 ℃恒温箱中继续孵育1.5 h，然后将切片在PBS中漂洗干净，继续SP反应1 h，最后DAB显色，在封闭避光的房间中操作，在显微镜下实时观察显色情况，出现棕黄色或棕褐色及时终止反应。然后洗净切片，苏木精复染，中性树胶封片，在显微镜下观察Nrf-2阳性细胞核数。

2 结果

2.1 低维生素D饲料喂养构建维生素D缺乏动物模型为验证VDD模型是否成功建立，检测母鼠血清25-(OH)-D水平。结果显示，VDD组母鼠血清25-(OH)-D(5.7±0.44 ng/ml)显著低于CTRL组(17.5±0.56 ng/ml)。以上结果表明，5周连续的低维生素D饲料喂养，成功构建维生素D缺乏小鼠模型。

2.2 母体孕期维生素D缺乏诱发IUGR在孕第19天剖杀孕鼠，观察妊娠结局。结果如表1所示，与CTRL组相比，VDD组活胎数减少(t=1.123，P<0.05)，晚死胎数增加(t=1.123，P<0.05)，早死胎数和吸收胎数在两组之间无差异。称量胎鼠和胎盘重量，结果显示VDD组胎鼠重量 (t=2.517，P<0.01)和胎盘重量(t=5.073，P<0.01)均是低于CTRL组。测量胎鼠身长和胎盘直径，发现VDD组胎鼠身长 (t=1.830，P<0.01)和胎盘直径(t=1.831，P<0.01)均低于CTRL组。

表1 两组孕鼠出生结局

2.3 母体孕期维生素D缺乏上调胎盘雌激素合成通过Western blot法检测小鼠胎盘雌激素合成关键酶CYP19的蛋白表达水平，结果如图1所示，VDD组小鼠胎盘CYP19蛋白表达水平高于CTRL组(图1A、1B)，差异有统计学意义(t=4.532，P<0.01)。此外，检测小鼠胎盘孕激素合成关键酶蛋白表达水平，结果提示孕激素合成关键酶CYP11A1和3β-HSD2蛋白表达在CTRL和VDD两组之间无差异 (图1A、1C、1D)。通过免疫放射分析法检测两组孕鼠血清中雌激素和孕激素水平，结果提示，尽管孕激素水平在两组孕鼠之间差异无统计学意义，但是雌激素水平在VDD组孕鼠中显著升高(t=2.637，P<0.01)，见图1E、1F。

图1 母体孕期维生素D缺乏对小鼠甾体激素的影响A：胎盘CYP19、CYP11A1和3β-HSD2蛋白条带；B：CYP19蛋白条带定量分析；C：CYP11A1蛋白条带定量分析; D：3β-HSD2蛋白条带定量分析; E：孕鼠雌激素水平；F：孕鼠孕激素水平；与CTRL组比较：**P<0.01

2.4 母体孕期维生素D缺乏诱发胎盘氧化应激通过Western blot法检测小鼠胎盘氧化应激相关蛋白表达水平，结果如图2所示，尽管HO-2蛋白在两组之间表达差异无统计学意义 (图2A、2B)，但是HO-1表达水平在VDD组小鼠胎盘中升高(t=6.102，P<0.01)，见图2A、2B；同时，小鼠胎盘中NADPH氧化酶水平检测结果提示，维生素D缺乏对小鼠胎盘NOX-2表达无影响(图2)，但是维生素D缺乏明显上调了小鼠胎盘NOX-4表达(t=2.655，P<0.01) ，见图2A、2B；小鼠胎盘3-NT蛋白水平检测结果表明，3-NT蛋白在VDD组表达升高(t=3.654，P<0.01) ，见图2。此外，免疫组织化学法检测小鼠胎盘Nrf-2的核转位水平结果显示，VDD组小鼠胎盘中Nrf-2核转位水平明显升高(t=5.318，P<0.01) ，见图3A、3B。

图2 母体孕期维生素D缺乏对小鼠胎盘氧化应激的影响A:胎盘HO-1、HO-2、NOX-2、NOX-4和3-NT蛋白条带；B：蛋白条带定量分析；与CTRL组比较：**P<0.01

图3 母体孕期维生素D缺乏对小鼠胎盘Nrf-2核转位的影响A：免疫组化检测小鼠胎盘Nrf-2的核转位；B：Nrf-2阳性细胞核数；与CTRL组比较：**P<0.01

3 讨论

本研究通过在无紫外光照环境中，连续5周低维生素D饲料喂养小鼠构建VDD小鼠模型，结果显示VDD组小鼠血清25-(OH)-D水平显著低于对照组，表明VDD小鼠模型被成功构建。进一步将VDD雌鼠与正常雄鼠交配，结果显示VDD组活胎数减少，晚死胎数增多，VDD组胎鼠和胎盘重量显著减轻，胎鼠身长和胎盘直径明显降低。以上结果表明，母体孕期维生素D缺乏可诱发IUGR，但是具体机制不明。

越来越多的研究表明，雌激素和孕激素是人体中重要的甾体类固醇激素，在妊娠过程中发挥着重要作用。妊娠早期孕激素和雌激素主要由黄体产生，而在妊娠中、晚期可由胎盘合体滋养细胞合成和分泌，正常水平的雌激素和孕激素对胎盘功能维持和胎儿生长发育发挥重要作用[11]。在正常妊娠过程中，母血中雌激素会出现短暂的、生理性的升高，但是在妊娠早起，过高的雌激素会抑制绒毛外血管内皮生长因子表达和子宫螺旋动脉的浸润，抑制胎盘的发育，进而导致IUGR[12]。CYP19是一种重要的雌激素合成限速酶，调节雌激素的合成。本研究显示，CYP19蛋白在VDD胎盘中表达显著升高；此外，VDD组孕鼠血清雌激素水平升高，而孕激素合成限速酶以及孕激素水平在无明显改变。以上实验结果提示，母体孕期维生素D缺乏可通过促进胎盘雌激素合成，升高母体内雌激素水平抑制胎盘的发育和功能进而导致IUGR。

氧化应激是指机体内活性氧的过量产生和机体内抗氧化能力的不平衡，活性氧是机体内游离的自由基，会导致氧化还原状态失衡，引起脂质过氧化、蛋白质羰基化以及DNA损伤等[13]。已有研究[13]表明，胎盘的氧化应激在IUGR的病理过程中发挥着重要作用。机体内活性氧的过量产生，可抑制胎盘的血管重构和营养物质的摄取和运输，改变激素的合成，损伤胎盘功能和胎儿发育，诱发IUGR。而本研究发现母体孕期维生素D缺乏上调胎盘HO-1、NOX-4和3-NT蛋白达水平，促进胎盘Nrf-2核转位水平，以上结果表明孕期母体维生素D缺乏诱发胎盘氧化应激，损伤胎盘的发育。提示孕期母体维生素D缺乏可能通过诱发氧化应激促进胎盘雌激素合成而导致IUGR，然而，维生素D缺乏诱发胎盘氧化应激的作用机制目前并不清楚。

Nrf-2是细胞对抗氧化损伤的重要作用机制之一，通过调节细胞保护基因的表达，维持细胞正常功能。Nrf-2的表达主要受细胞内泛素化过程和蛋白酶体降解系统调节，在静息状态下，Nrf-2与滞蛋白-3型泛素连接酶接头蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)相结合而锚定在细胞质中，而当细胞内部受到活性氧或亲电体刺激后，可引发Keap1构象改变并导致Nrf-2游离出来，转位进入细胞核与抗氧化反应元件 (antioxidant response element, ARE)结合发挥转录因子作用，调节下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化及抗炎蛋白表达[14]。维生素D可通过维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)激活细胞内的Nrf-2抗氧化系统，抵抗胞内氧化应激和炎症反应[15]。而维生素D缺乏常导致VDR核转位减少，细胞核内VDR表达降低，进而诱发机体氧化应激[16]。因此，有理由推测母体孕期维生素D 缺乏通过诱发胎盘氧化应激，导致过多的活性氧产生，损伤胎盘功能和促进胎盘雌激素合成，进而诱发IUGR。

综上所述，母体孕期维生素D缺乏导致IUGR，其作用机制可能是维生素D缺乏诱发胎盘氧化应激，导致机体内活性氧过量产生，上调胎盘CYP19表达、促进雌激素合成，进而诱发IUGR。本研究为母体孕期维生素D缺乏诱发IUGR的机制提供了新的证据。