VGLL4基因多态性与非贲门胃癌遗传易感性的关系

杨 霞，董文杰，高 芳，武金宝，马立聪，党 彤，孟宪梅，贾彦彬,,4

近年来，有研究[1-2]表明一些疾病的发生发展与个体的遗传易感性密切相关。一些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以作为胃癌筛查的重要遗传标志物以及防治的重要靶点。残留样蛋白质家族成员4 (vestigial like family member 4，VGLL4)在胃癌的发生发展中发挥了重要作用，VGLL4是研究胃癌变的重要候选基因[3-5]。然而，目前关于VGLL4基因多态性与胃癌的关系还未见有报道。因此，该研究在包头汉族人群中分析了VGLL4基因多态性与非贲门胃癌遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取 2008 年至2020 年包头市肿瘤医院经组织病理学诊断为非贲门胃癌的 450 例患者为病例组。所有患者均排除继发病例和复发病例，且未接受过手术治疗及放、化疗。其中男性 336 例，女性 114 例，年龄 26～83 岁，平均年龄为(60.76±10.64)岁。450例正常对照来自同期社区体检人群，均排除癌症病史和明显的胃部疾病史，且排除遗传病史。其中男性 336 例，女性 114 例，年龄 26～93岁，平均年龄为(59.66±11.43)岁；病例组和对照组在年龄和性别方面相匹配(年龄：t=-1.489，P=0.137；性别：χ2=0，P=1.000)。900 例研究样本均为在包头地区居住 5 年以上的汉族人群，相互之间无血缘关系。所有纳入研究的对象均签署了知情同意书，本研究已获得包头医学院伦理学委员会的批准[包医伦审人体2021第(006)号]。

1.2 方法

1.2.1SNPs的筛选 在HapMap 数据库( http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中筛选VGLL4的标记单核苷酸多态性(Tag-SNPs)。要求SNP在中国汉族人群中最小等位基因频率(minor allele frequency，MAF)>5%，连锁不平衡值r2>0.8，在筛选出的Tag-SNPs中优先选择文献报道的可能和疾病关联的SNPs进行初步研究。最终选择了 SNP rs1803489、rs7617620、rs13078528 进行研究。

1.2.2基因分型 对研究对象静脉采血2 ml，用EDTA-K2抗凝。静脉血液离心后分层，将血浆和血细胞分离分装，并分别编号置于-20 ℃医用冰箱保存备用。用人血液基因组 DNA 提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取外周血白细胞中的人基因组DNA。用Primer 5软件设计引物，设计好的引物送北京博迈德基因技术有限公司合成。PCR反应体系共25 μl，包含DNA 50 ng、2×Taq Master Mix 12.5 μl、上下游引物(10 μmol/L)各1 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，最后72 ℃延伸5 min。具体引物序列及PCR产物长度见表1。PCR产物用相应的限制性内切酶进行酶切，内切酶购自北京全式金生物技术有限公司。酶切反应体系共10 μl，包含PCR产物3 μl、10×NE Buffer 1 μl、限制性内切酶5 U，并置于内切酶最适反应温度下作用60 min。对酶切产物进行2 %琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小判断基因型。具体内切酶及相应的反应温度和酶切片段长度见表1。

表1 PCR引物序列和长度及酶切反应条件

1.3 统计学处理采用 SPSS 17. 0 统计软件进行统计分析。在对照组中用拟合优度χ2检验来检测VGLL4基因各SNP位点的基因型分布是否符合Hardy-Weniberg平衡，以验证研究样本在包头地区汉族人群中是否具有群体代表性和可比性，若P>0.05则表示各位点的基因型分布符合Hardy-Weniberg平衡。采用独立样本t检验比较分析年龄在病例组和对照组间的分布差异; 采用χ2检验比较性别在病例组和对照组的分布差异。在共显性、显性、隐性、超显性4种遗传模式下评估各SNP位点非贲门胃癌的关系。用非条件性Logistic回归计算出比值比(odds ratio，OR)和95%可信区间(confidence interval，CI)，OR和95%CI经年龄、性别调整。采用Haploview 4.2软件对VGLL4基因各SNP位点的连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)进行分析并构建单体型，构建的单体型与非贲门胃癌的关联性采用多重Logistic回归进行分析。

2 结果

2.1 各SNP位点在不同遗传模型下与非贲门胃癌发病风险的关系对照组中VGLL4基因SNP rs1803489、rs7617620、rs13078528 位点的基因型频数分布符合Hardy-Weniberg平衡(rs1803489：χ2=0.117，P=0.943；rs7617620：χ2=5.374，P=0.068；rs13078528：χ2=1.200，P=0.549)。

在共显性、显性、隐性和超显性4种遗传模型下，分析VGLL4基因各SNP位点与非贲门胃癌发病风险的关系。结果显示 SNP rs1803489在共显性、显性和超显性模型中均与非贲门胃癌的发病风险关联，其中共显性模型为最佳遗传模型，其最小信息准则(akaike information criterion，AIC)和贝叶斯信息准则(bayesian information criterion，BIC)值最小。与携带GG基因型相比，携带AG基因型者非贲门胃癌的发病风险增加(AGvsGG，OR=1.511，95%CI=1.095～2.085)。SNP rs7617620、rs13078528 与非贲门胃癌的发病风险均没有关联(P>0.05)。见表 2。

表2 SNP与非贲门胃癌发病风险的关联[n(%)]

2.2VGLL4基因单体型与非贲门胃癌发病风险的关系对VGLL4基因的3个SNP进行连锁不平衡分析发现：rs1803489、rs7617620、rs13078528三个位点连锁程度低，未能构建出单体型块。

3 讨论

VGLL4基因位于染色体3p25.3-3p25.2，包含14个外显子，编码VGLL4。VGLL4的羧基末端有两个TDU结构域，可以与转录因子TEA域蛋白质家族成员(TEA domain family members，TEADs)结合并执行抑制癌细胞生长和进展的功能[6]。

Hippo信号通路是一条肿瘤抑制通路，转录共激活因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)作为其下游至关重要的效应因子可以与TEADs结合，并激活其靶基因的转录，从而驱动细胞增殖、转化、侵袭。在多种人类消化系统肿瘤包括胃癌、结肠直肠癌和肝癌等的研究中发现YAP与肿瘤的发生发展密切相关[3,7-8]。然而，VGLL4可以通过其TDU结构域竞争性结合TEADs并抑制YAP和TEADs之间的相互作用，从而抑制癌基因的表达[9]。

目前，关于VGLL4与胃癌的相关性研究较多。在人胃癌中，VGLL4在肿瘤组织中的mRNA和蛋白质表达水平显著低于正常组织和肿瘤周围组织[3-4]。VGLL4mRNA及蛋白质的表达水平与肿瘤大小、肿瘤分期、浆膜浸润、淋巴管侵袭和淋巴结转移呈负相关[3,5]。同时，VGLL4的表达水平与胃癌患者的5年存活率呈负相关，是胃癌的预后标志物[5]。综上所述，VGLL4蛋白在胃癌组织中低表达，并与淋巴结转移、TNM分期、侵袭性和5年生存率等临床病理特征存在相关性，是人类胃癌的潜在肿瘤抑制因子。同时，研究也提示VGLL4基因是研究胃癌变的重要候选基因之一。因此，本研究在包头地区汉族人群中检测了VGLL4的基因多态性与非贲门胃癌遗传易感性的关系，为胃癌变的筛查、诊断和防治提供实验基础和理论依据。

本研究显示，在包头汉族人群中VGLL4基因SNP rs1803489与非贲门胃癌的发病风险相关联。在共显性模型中，与GG基因型携带者相比，AG基因型携带者非贲门胃癌的发病风险增加(OR=1.511，95%CI=1.095～2.085)；在显性模型中与GG基因型携带者相比，AG+AA基因型携带者非贲门胃癌的发病风险增加(OR=1.491，95%CI=1.086～2.047)；在超显性模型中，与GG+AA基因型携带者相比，AG基因型携带者非贲门胃癌的发病风险增加(OR=1.510，95%CI=1.094～2.082)；其中共显性模型为最佳模型，其AIC和BIC值最小，因此AG基因型可能是包头汉族人群非贲门胃癌发生的危险因素。本研究结果和VGLL4SNP rs1803489与肺癌遗传易感性研究[10]的结果一致，提示rs1803489可能是VGLL4在肺癌、胃癌等癌症发生的共同作用通路上的遗传标记，AG基因型是发病的危险因素。SNP rs13078528在一项meta分析研究中被鉴定为与成人身高相关的突变[11]；SNP rs7617620在全基因组关联研究分析中与合并尼古丁依赖和严重抑郁症相关联[12]。本研究结果显示SNP rs13078528、rs7617620与非贲门胃癌的发病风险没有关联，说明SNP rs13078528、rs7617620可能在非贲门胃癌的发病中不起主要作用。本研究结果与上述研究结果有差异，提示相同的SNP在不同的疾病中所起的作用可能不同。然而，由于本研究的样本量偏低，还需要扩大样本量进一步研究，以明确SNP rs1803489、rs13078528、rs7617620与非贲门胃癌遗传易感性的确切关系。