超声联合BRAF V600E基因检测模型在主动监测甲状腺微小癌侵袭性中的应用

王雨竹，彭 梅，姜 凡，王圣应，刘建军，陶 堃，杨 杨，何 杰

甲状腺癌的发病率在全球不断攀升，其中直径≤1 cm的甲状腺微小乳头状癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)发病率占50%以上[1]。2015年美国甲状腺协会(American thyroid association，ATA)在《成人甲状腺结节和分化型甲状腺癌患者管理指南》中提出，对低侵袭性的PTMC患者可以考虑采用主动监测代替立即手术治疗[2]。PTMC的侵袭性特征有甲状腺腺外侵犯、发生淋巴结转移及远处转移[3-4]。BRAF基因突变是甲状腺乳头状癌最常见的基因突变，而BRAF突变以BRAF V600E基因突变为主。部分研究[5]表明，BRAF V600E基因突变与PTMC的侵袭性有一定相关性。该研究旨在通过结合患者临床特征、术前超声检查、BRAF V600E基因检测，建立甲状腺结节侵袭性的风险预测模型，为临床医师术前制定更好的治疗方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集在中国科学技术大学第一附属医院西区头颈乳腺外科初次行手术治疗，并经术后病理证实为PTMC且符合纳入标准的患者共264例，男66例，女198例。将2017年10月至2019年4月收集的154例PTMC患者纳入模型组，2019年5月至2021年1月收集的110例PTMC患者纳入验证组。纳入标准：① 术后病理为单发癌灶；② 具有完整的超声检查资料、临床资料、BRAF V600E基因检测；③ 手术切除范围至少为患侧腺叶切除+患侧中央区淋巴结清扫。排除标准：① 合并其他肿瘤；② 术前超声检查资料不完整、未做BRAF V600E基因检测；③ 未行淋巴结清扫。

1.2 仪器与方法超声检查采用GE Logiq E9 超声诊断仪，L15 探头，探头频率6～15 MHz。检查者取仰卧位，头部充分后仰暴露颈前区，做甲状腺两侧叶、峡部的横断面及纵断面滑动扫查。常规超声扫查可发现甲状腺可疑恶性结节，观察结节位置、测量结节大小、观察结节边缘、微钙化(直径≤1 mm)、纵横比、回声及血流分布情况。对颈部淋巴结进行广泛扫查，观察检出的淋巴结形态、大小、包膜、皮髓质回声以及与周围组织关系，观察其内部及周边血流分布情况。超声疑为淋巴结转移是指淋巴结中出现团块状高回声或无回声区、点状强回声，高回声内血流信号丰富。超声疑为腺外侵犯是指结节接触甲状腺包膜>25%或甲状腺包膜的回声线连续性中断。

BRAF V600E基因检测：收集符合标准的石蜡标本，选择蜡块中间部分，行10 μm切片，使用武汉友芝公司生产的人类BRAF基因V600E突变检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行BRAF V600E 突变检测，利用实时荧光PCR原理，针对BRAF基因第1799位核苷酸上V600E突变进行定性检测。严格按照使用说明书操作，待反应结束分析收集到的荧光信号，在阴性、阳性对照、内部质量控制均在合适范围的前提下，600Glu PCR反应液管突变检测Ct值≥38或无Ct值，样本为阴性；600Glu PCR反应液管突变检测Ct值<38，则计算该反应管的△Ct值。若该反应管的△Ct值小于9，则样本为600 Glu的突变阳性；反之则为突变阴性。

2 结果

2.1 模型组单因素分析结果模型组154例PTMC患者中男36例，女118例。对临床及超声特征进行单因素分析，结果显示，患者性别(P=0.003)、年龄(P=0.005)、肿瘤最大径(P=0.001)、微钙化(P=0.001)、超声疑为腺外侵犯(P<0.001)、超声疑为淋巴结转移(P=0.012)、BRAF V600E基因突变(P=0.019)均与PTMC的侵袭性有关，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 模型组多因素Logistic回归分析将表1中有统计学意义的相关因素纳入多因素Logistic回归分析，结果显示患者性别、年龄、肿瘤最大径、微钙化、超声疑为腺外侵犯、超声疑为淋巴结转移、BRAF V600E基因突变均是PTMC的侵袭性的危险因素。见表2。

表1 单因素分析PTMC患者侵袭性的相关因素

表2 多因素Logistic分析结果

2.3 模型组ROC曲线以侵袭性为纵坐标，分别以超声指标(肿瘤最大径、微钙化、超声疑为腺外侵犯、超声疑为淋巴结转移)、BRAF V600E基因、患者临床特征(性别、年龄)、超声指标联合临床特征、BRAF V600E基因联合临床特征、超声指标联合BRAF V600E基因以及三者联合为横坐标，绘制ROC曲线评估其对PTMC侵袭性的预测效能(图1)，其曲线下面积AUC分别为0.754(95%CI：0.678～0.831)、0.581(95%CI：0.491～0.671)、0.677(95%CI：0.592～0.762)、0.795(95%CI：0.725～0.864)、0.694(95%CI：0.612～0.776)、0.780(95%CI：0.709～0.852)、0.813(95%CI：0.747～0.879)。其中三者联合为横坐标所绘制的AUC为0.813(95%CI：0.747～0.879)，高于其他指标。超声指标联合BRAF V600E检测及患者临床特征对PTMC患者侵袭性预测效能最好。

图1 模型组各指标预测效能

2.4 构建风险预测模型以患者临床特征、超声指标、BRAF V600E基因检测为危险因素构建风险预测模型。将各危险因素进行分类，指定每组的参考值Wij，选择合适的分组作为基础风险参考值WiREF，记为0分。结合回归系数βi，以及各组参考值Wij，计算各组与WiREF之间的距离D。设定常数B为1，计算危险因素每个分类所对应的分值，数值四舍五入取整数，结果见表3。根据结果，将每个危险因素的分值加起来计算总分，范围为：0～8分。

表3 危险因素赋分

表4 风险预测概率表

同时Hosmer-Lemeshow检验结果提示P=0.663，确定系数χ2=5.861。说明模型拟合优度好，预测结果准确可靠。

2.5 验证组ROC曲线验证组共纳入经病理证实为PTMC的患者110例，其中男性30例，女性80例，26～68(42.4±10.3)岁。将患者数据代入预测模型，计算风险预测概率，以术后病理结果作为金标准，绘制ROC曲线(图2)。所得AUC为0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值为0.450 2，灵敏度为83.3%，特异度为62.9%，模型具有较好的诊断效能。cut-off值为0.450 2，以总分≥5分为预测患者甲状腺结节有侵袭性可能。图3所示为一位甲状腺微小乳头状癌伴颈部淋巴结转移患者的超声图像。患者男性，36岁，肿瘤最大径8 mm，无微钙化，结节外周区域甲状腺包膜线连续性中断，颈部VI区淋巴结内见液性暗区，BRAF V600E基因检测为突变型。预测模型计算侵袭性的风险为94.3%，预测为有侵袭性，与病理结果相符。

图2 预测模型在验证组中的预测效能

图3 甲状腺微小乳头状癌伴颈部淋巴结转移的超声图像A：甲状腺横切面图；B颈部VI区淋巴结(箭头所示淋巴结内见液性暗区)

3 讨论

PTMC一般生物学行为温和，一部分患者可能终生不表现出临床症状。越来越多的观点认为对于低侵袭性的PTMC，可采取主动监测的方法来代替手术切除[2,6-7]。多项研究[8]表明，对于主动监测期间有肿瘤生长或淋巴结转移的患者，补救手术有良好的效果和预后，同时主动监测组患者的术后并发症及医疗费用明显减少。但部分病例具有侵袭性，原发灶常侵出甲状腺包膜，侵犯周围组织，淋巴结转移较早且范围广，发生远处转移，患者的生存率和预后不佳。因此，对于PTMC侵袭性的预测能为临床选择合适的治疗方案提供帮助。

研究[9]表明男性、年龄<45岁是PTMC患者侵袭性的危险因素，本研究中女性 ∶男性为3 ∶1，OR值为2.611，年龄<45岁OR值为2.356，同样验证了这一点。微钙化反应出的是病理中砂砾体，是钙化的一钟特殊类型，主要是肿瘤生长迅速、血供不足、细胞凋亡，使癌组织内局部形成钙磷沉积微环境，形成微钙化。多项研究[10-11]表明微钙化对甲状腺良恶性结节的定性诊断有重要意义，超声发现微钙化时往往提示为恶性结节。王猛 等[12]通过对575例PTMC患者的超声特征与颈部淋巴结转移的相关性分析，认为微钙化是PTMC患者颈部淋巴结转移的危险因素，本研究结果与之一致。一般认为肿瘤最大径越大，其发生侵袭性行为的风险就越高。肿瘤最大径被认为是影响PTMC进展的独立危险因素，本研究表明肿瘤最大径>5 mm是PTMC患者侵袭性的独立危险因素，该结论与Cheng et al[13]的研究是相吻合的。近年来，应用分子生物学有望解决一些甲状腺组织诊断难的问题。BRAF V600E基因突变是甲状腺乳头状癌最常见的基因突变类型。研究[14]显示BRAF基因突变与PTMC的侵袭性密切相关，本研究表明BRAF V600E基因突变型的患者出现侵袭性行为的风险更大。

以上各因素需综合分析，因此本研究对于每个危险因素，选择一个合适的分组作为基础风险参考值，计算出预测模型，并将模型带入110例验证组中评估，以总分≥5分为预测患者甲状腺结节有侵袭性分数，所得AUC为0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值为0.450 2，模型具有较好的诊断效能。本研究也存在一些局限性。PTMC中存在多种分子标志物，但本研究并未分析其他分子标志物与PTMC患者不良预后之间的关系，也缺乏未手术的长期观察结果。对PTMC侵袭性的预测还需要大样本、多中心、前瞻性研究的证实。