miR-1285通过YAP对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制

张红霞，吴广胜

慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种骨髓增生性肿瘤，酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKI)作为CML治疗的临床一线用药，仍有许多患者对TKIs发生耐药[1]。CML与Wnt、Notch、Hippo等信号通路的失调相关[2]。转录共激活因子Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1, YAP1)是Hippo信号通路中的癌基因，在肿瘤发生中起着重要的作用[3]。YAP参与了癌症恶性行为的维持[4-6]，有研究[7]显示抑制YAP的表达，CML细胞生长减慢增加药物的敏感性，另有研究[8]表明YAP的磷酸化水平与CML细胞生长成正比。

近年来微小RNA(microRNA，miRNA)在调控基因表达、肿瘤发生及发展发挥了重要作用[9]。miR-1285，也称为miR-1285-1，miR-1285-3p，位于7q21-q22中[10]。miR-1285在多种癌症中发挥抑癌作用[11]，而在CML中的作用尚不清楚。CML中许多microRNA处于失衡状态，多项研究[12]证明这些microRNA在调节白血病细胞的增殖、侵袭和转移方面发挥了重要作用，但是否会作用于YAP这条通路尚无有力证据。因此该研究主要侧重于miR-1285通过靶向YAP对慢性粒细胞白血病K562细胞的增殖、凋亡以及对其作用机制的初步探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、SYBR Green试剂盒(Thermo Fisher公司)，CCK8检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒(Abcam公司)，RIPA细胞裂液(BOSTER公司)，1%青链霉素、10%胎牛血清(Gibco公司)，质粒(上海Genepharma公司)，具体序列见表1。

表1 质粒序列

1.2 K562细胞的制备慢性粒细胞白血病K562细胞购于武汉普诺赛公司，使用含1%青链霉素10%胎牛血清的DMEM培养基培养，于37 ℃含有5%CO2的细胞培养箱中培养，每隔24 h进行更换培养基处理并1 ∶2传代。选择对数期生长的细胞进行下一步实验细胞。质粒的转染使用Lippofectamine 3000作为载体。

1.3 CCK-8法检测K562细胞增殖情况按5×105/ml密度将K562细胞种植在24孔板中并设置空白组，培养12 h后，每组设置3个对照组，将质粒与K562细胞共培养48 h与72 h后，每孔加入25 μl CCK-8试剂，避光，37 ℃条件中孵育1.5 h，测定酶标仪在450 nm吸光度时的吸光度(A)值，以此来计算细胞的增殖率。计算方法：增殖率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.4 流式细胞仪检测K562细胞凋亡情况按5×105/ml密度将K562细胞种植在6孔板中，按照1.3项处理后的K562细胞使用预冷的PBS冲洗干净后，加入胰酶消化后收集细胞，离心获得沉淀，使用PBS重悬细胞后分装，分别加入PI和Annexin V-FITC抗体后，设置对照组，避光情况下上机检测。

1.5 实时荧光定量PCR检测K562细胞中miR-1285的表达水平按照1.3项处理后的K562细胞，TRIzol法提取细胞中总RNA，调平后逆转录成cDNA，反应条件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。将所得cDNA进行实时荧光定量PCR，所用PCR引物序列见表1。扩增条件为:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循环次数40次。使用2-ΔΔCt计算公式得出mRNA的表达量。

1.6 Western blot法测定蛋白表达量按照1.3项处理后的K562细胞加入RIPA细胞裂解液，获取K562细胞中总蛋白样品，用BCA法检测上样蛋白浓度，调整蛋白浓度后使各组浓度一致，然后使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离蛋白并转移至PVDF膜，加入兔抗鼠单克隆抗体YAP、P-EGFR、EGFR、BAX、Bcl-2、GAPDH(稀释比1 ∶800)于4 ℃条件下孵育24 h后，充分去除一抗并于常温条件下加入山羊抗兔二抗(稀释比1 ∶20 000)孵育2 h，化学发光法检测各分子的蛋白表达情况，使用Image J软件处理灰度值并计算相对蛋白表达量。

2 结果

2.1 转染质粒后K562细胞内miR-1285 mRNA的表达量在转染后48 h检测细胞内miR-1285的表达量，与mimics control组比较，miR-1285 mimics组表达升高，与inhibitor control组比较，miR-1285 inhibitor组表达下降(P<0.05)。而mimics control组与inhibitor control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 不同处理组miR-1285表达情况A：mimics组；B：mimics control组；C：inhibitor组；D：inhibitor control组；与mimics control组比较：*P<0.05；与inhibitor control组比较：#P<0.05

2.2 过表达miR-1285后抑制K562细胞增殖转染质粒48 h，与miR-1285 inhibitor组比较，miR-1285 inhibitor组、mimics control组、inhibitor control组均可促进K562细胞增殖(P<0.05)；而通过过表达miR-1285，miR-1285 mimics组较mimics control组增殖减弱，差异有统计学意义(P<0.05)。在相同的培养环境下，miR-1285 inhibitor组细胞增殖明显高于inhibitor control组(P<0.05)，见图2。

图2 不同处理组K562细胞增殖情况A：mimics组；B：mimics control组；C：inhibitor组；D：inhibitor control组；与mimics control组比较：*P<0.05；与inhibitor control组比较：#P<0.05

图3 不同处理组K562细胞凋亡情况A：mimics组；B：mimics control组；C：inhibitor组；D：inhibitor control组；与mimics control组比较：*P<0.05；与inhibitor control组比较：#P<0.05

2.4 凋亡相关分子BAX、Bcl-2的蛋白表达Western blot结果显示，与mimics control组比较，mimics组BAX升高，而Bcl-2降低，差异有统计学意义(P<0.05)；而与inhibitor control组比较，miR-1285 inhibitor组的BAX表达降低，而Bcl-2表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 不同处理组K562凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2表达情况A：mimics组；B：mimics control组；C：inhibitor组；D：inhibitor control组；与mimics control组比较：*P<0.05；与inhibitor control组比较：#P<0.05

2.5 YAP及EGFR下游相关分子的蛋白表达Western blot结果显示，过表达miR-1285后，YAP的表达下降，而敲低miR-1285会使YAP的表达上升；与mimics control组比较，miR-1285 mimics组的YAP、P-EGFR表达量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与inhibitor control组比较，miR-1285 inhibitor组的YAP、P-EGFR表达量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。各组之间EGFR未见明显变化，见图5。

图5 不同处理组K562细胞中YAP、EGFR、P-EGFR的表达情况A：mimics组；B：mimics control组；C：inhibitor组；D：inhibitor control组；与mimics control组比较：*P<0.05；与inhibitor control组比较：#P<0.05

3 讨论

近年来关于microRNA的研究逐渐增多，其中在抑制肿瘤方面有较多发现。有研究[13]显示在CML中使用YAP抑制剂维替泊芬可抑制其凋亡，促进增殖。本研究显示使用miR-1285质粒后，使miR-1285表达增加时，K562细胞增殖减弱，而凋亡增加；相同条件下使miR-1285下调后，K562细胞出现增殖明显而抑制凋亡。这与Huang et al[14]在胰腺癌中发现miR-1285过表达后其抑制恶性生物学行为，可能是抑制了YAP的表达；而使miR-1285降低时，可得到相反的结果。

通过过表达或敲低miR-1285，可以观察到K562细胞中miR-1285表达升高及降低，与对照组相比，差异有统计学意义,证明可有效建立细胞模型。当过表达miR-1285后，与inhibitor组相比，K562细胞凋亡增加，而使miR-1285表达降低时，细胞凋亡降低，可能是由于过表达miR-1285后可抑制YAP的表达从而使K562细胞增殖减弱，进而凋亡增加，当使miR-1285表达降低后对YAP的抑制作用减弱，YAP表达增加，促进K562细胞的增殖，抑制凋亡。这与相关研究[13]结果一致。CCK-8法检测结果显示，过表达miR-1285后，K562细胞增殖减弱，而敲低miR-1285后，可促进miR-1285的增殖，增殖结果与流式结果相一致；其原因也与上述一致，可能是由于抑制或促进YAP的表达进而影响了K562细胞的增殖。

对凋亡相关分子BAX与Bcl-2进行测定，结果显示mimics组BAX表达量升高，且明显高于其余三组，差异有统计学意义；当抑制miR-1285后，BAX的表达量较对照组下降，明显低于mimics组；而与之对应的促增殖因子Bcl-2在mimics组中表达明显低于三组，而在inhibitor组中Bcl-2表达高于其余三组，差异均有统计学意义；说明miR-1286可通过一系列信号通路作用于K562细胞的线粒体通路从而影响增殖与凋亡，过表达miR-1285后，细胞增殖能力减弱，可能是因为抑制了Bcl-2而促进BAX的表达，通过线粒体通路来影响细胞增殖情况。而敲低miR-1285后，这种抑制作用减弱，对线粒体凋亡通路影响较小，因此促进细胞增殖。然而这种是通过何种机制来发挥作用的不得而知。

有研究[15]显示miR-1285可通过YAP信号通路可调控卵巢癌的增殖、侵袭及转移。而另有一项研究[7]证明YAP抑制剂可作用于K562细胞介导Hippo信号通路抑制增殖、促进凋亡。miRNA在CML中的研究较少，但YAP对CML的作用已有大量研究[16]证实，因此笔者猜想miR-1285是否也能作用于YAP进而影响K562细胞的生物学行为，对增殖、凋亡有何影响。本研究结果显示使miR-1285过表达后可抑制YAP的表达，通过对下游分子检测P-EGFR表达也下降，而非磷酸化的EGFR未见明显变化；当使miR-1285敲低后，这种抑制作用会减弱，相比对照组YAP的表达升高，下游分子P-EGFR的表达随之升高，而相应的非磷酸化EGFR表达不变，发生这种情况的原因可能是由于miR-1285作用于YAP使表达降低，进而抑制对下游分子的激活作用，使下游分子呈现出非磷酸化，而使miR-1285表达降低后，这种抑制作用会降低，影响其他分子对YAP的抑制作用，使YAP表达升高，再通过一系列信号通路影响K562细胞的线粒体凋亡通路，抑制BAX的表达，使Bcl-2的表达升高，促进增殖，抑制凋亡。

综上所述，YAP的表达异常参与了多种肿瘤细胞及血液系统疾病的生物学行为进程，与疾病的预后和转归均密切相关。miR-1285又可以通过作用于YAP使YAP表达异常，在CML细胞的增殖、凋亡方面发挥了重要作用。为后期研究microRNA在CML的作用机制提供思路，为后期靶向治疗提供新方向，可设计针对于CML的microRNA，为该病后期治疗提供一种新的靶向药物。