虫草素对老年大鼠心脏功能的保护作用及其机制

何佛容，陈 驰，潘媛媛，邓胜男，施 勇，陶雪飞

衰老是心血管疾病的危险因素之一[1]。心脏衰老的主要特征是舒张功能障碍、收缩力下降、脂质积聚、氧化应激、成纤维细胞的分泌异常、自噬减少和蛋白激酶途径信号的改变[2]。此外，衰老引起心房、心室、心肌等结构改变，导致心脏传导系统、血管系统的功能障碍[3]，严重威胁人们的健康。随着世界老年人口的增加，寻找缓解心脏老化、保护心脏功能的方法具有重要意义。

虫草素(cordycepin, Cor)是德国科学家Cunningham et al[4]从蛹虫草中提取的核苷类抗生素，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗癌等广泛药理活性[5]。Cor在营养保健和临床治疗方面具有巨大的潜力及研究价值。其中，Cor通过激活Akt/GSK-3β/p70S6K信号通路和HO-1表达，缓解大鼠心脏缺血/再灌注损伤[6]，但未见Cor在心脏衰老方面的报道。该研究探讨Cor对老年大鼠心脏功能的保护作用及其机制，以期为临床治疗提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物50只雄性SPF级SD大鼠，其中10只3月龄大鼠作为青年对照组，体质量(280±35.3) g，40只20 ～ 22月龄大鼠作为老年组，体质量(685±52.6) g，适应性饲养1周后，随机分组。所有大鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。动物实验遵循3R原则，给予动物人道关怀。

1.2 药物与试剂Cor购自上海源叶生物(货号B20196)；肌钙蛋白I(cardiac troponin Ⅰ，cTnI)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、肌红蛋白(myohemoglobin，Mb)试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司(货号：JLC6968、JLC662、JLC6960)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司(货号：ml076328、ml077384、ml076593)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司(货号：T2190)；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cleaved cysteine aspartic protease 9，cleaved Caspase 9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartic protease 9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartic protease 3，Caspase-3)等相关抗体购自上海艾博抗贸易有限公司；核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)等相关抗体以及辣根过氧化物酶标记的二抗购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；RIPA裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司(货号：C1053-500、)；二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量检测试剂盒购自上海炎熙生物科技有限公司(货号：PD-BCA-500)；4%多聚甲醛、二甲苯、乙醇、苏木精-伊红溶液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(货号：C104190、X139941、E111994、E196384)。

1.3 主要仪器SA703小动物雾化给药仪购自江苏赛昂斯生物科技有限公司；MR-96T酶标仪购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；EG1150石蜡包埋机购自德国莱卡Leica公司；S700A旋转式石蜡切片机购自深圳瑞沃德生命技术有限公司；ZX-S24恒温水浴锅购自上海知信实验仪器技术有限公司；XSP-8CA显微镜购自上海光学仪器厂；P6-VET实验动物超声诊断仪购自江苏大为医疗有限公司。

1.4 方法

1.4.1动物分组与造模 参考文献[7]，适应性饲养1周后，将10只青年大鼠作为青年对照组；将40只老年大鼠随机均分成4组，分别为老年模型组、Cor低剂量组、Cor中剂量组、Cor高剂量组。各给药组分别灌胃 5、10、20 mg/kg Cor，老年组与青年组灌胃等量的生理盐水，1次/d，共4周。各组大鼠室温饲养，正常自由饮水进食。末次给药后麻醉，进行超声心动图检测，腹主动脉取血后处死，解剖取心脏，冷的生理盐水清洗后，取部分用4%多聚甲醛固定，剩余组织制备匀浆待用。

1.4.2超声心动图检测大鼠心脏功能 各组大鼠吸入异氟烷雾化气体麻醉后，对左前胸区域脱毛处理，仰卧位固定于加热板上，设置温度为37 ℃，腹部朝上，稍微向左倾斜，实时监测心电图，并进行超声检查。大鼠胸部涂耦合剂，将超声诊断仪的探头放置在心脏胸骨左缘并移至乳头肌水平，分别运用二维B型超声及M型超声，显示并记录左室短轴切面及左心室运动曲线，获得大鼠的心率(heart rate，HR)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短轴收缩率(fractional shortening，FS)指标数据。

1.4.3ELISA法检测血清中心脏功能损伤标志物水平和氧化应激标志物水平 取血后，离心收集上清液。按照cTnI、CK-MB、Mb、SOD、MDA、LDH试剂盒说明书进行操作。将样品放入反应孔孵育45 min后洗涤。加入生物素标记的抗体反应30 min，显色剂15 min。加入终止液，采用酶标仪进行检测。

1.4.4HE染色观察心脏组织病理形态 取出固定的组织，修剪后进行脱水透明处理，用梯度乙醇从低浓度到高浓度浸洗，随后浸入二甲苯中，10 min后浸入蜡中。采用石蜡包埋机对浸蜡后的标本做进一步包埋，冷却1 h后进行切片，并平铺于35～38 ℃的水面上，使蜡片自然展平，取出蜡片置于载玻片上，用滤纸吸收多余的水分，移至恒温箱中烘烤15～20 min进行脱蜡处理，最后使用苏木精-伊红溶液进行染色，使用显微镜观察并拍照分析。

1.4.5TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况 制作石蜡切片后进行脱蜡、水合、透明处理，在标本上分别加入TUNEL反应混合液，加入盖玻片反应1 h, 随后用PBS溶液漂洗3次，加入DAB底物反应10 min后漂洗3次。用显微镜观察凋亡细胞形态。

1.4.6Western blot检测心肌细胞中凋亡相关蛋白的表达 取制备的心脏组织匀浆液，加入RIPA裂解液，冰浴、离心后用BCA试剂盒测定蛋白浓度，煮沸变性后获取上样样本，经SDS-PAGE分离、转膜、封闭后，采用cleaved Caspase 9、cleaved Caspase 3、Caspase 3、Nrf2、NQO1、HO-1等相关一抗进行孵育，4 ℃过夜，TBST溶液洗涤3次后采用相关二抗进行孵育，1.5 h后加入发光液，显色处理，并统计灰度值，计算相应蛋白表达量，实验重复3次。

2 结果

2.1 Cor对老年大鼠心脏功能的影响与青年对照组相比，老年模型组HR、LVEF、FS的水平降低(P<0.05)，与老年模型组相比，Cor中、高剂量组HR、LVEF、FS的水平升高(P<0.05)，见表1。提示Cor能够缓解心脏功能指标的降低，在一定程度上改善心脏收缩、舒张功能。

表1 Cor对老年大鼠心脏功能的影响

2.2 Cor对老年大鼠心脏功能损伤标志物水平的影响cTnI、CK-MB、Mb是心脏功能损伤标志物。与青年对照组相比，老年模型组CK-Mb、Mb、cTnI 的水平升高(P<0.05)，与老年模型组相比，Cor中、高剂量组CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低(P<0.05)，见表2。提示Cor能够降低心脏功能损伤标志物水平。

表2 Cor对老年大鼠心脏功能损伤标志物水平的影响

2.3 Cor对老年大鼠心脏组织病理学的影响青年对照组大鼠心肌细胞排列整齐，结构清晰，细胞无肿胀、变性坏死；老年模型组心肌细胞排列疏松紊乱，有空泡样变性，部分心肌溶解坏死，肌纤维肥大断裂；Cor各给药组与老年模型组相比，细胞排列紊乱、肿胀、坏死，肌纤维自溶、断裂的现象减轻，见图1。提示Cor能够缓解组织结构的紊乱和病变，改善心肌细胞损伤。

图1 Cor对老年大鼠心脏组织病理学的影响 ×400A:青年对照组；B：老年模型组；C：Cor低剂量组；D：Cor中剂量组；E：Cor高剂量组

2.4 Cor对老年大鼠心脏组织氧化应激指标的影响与青年对照组相比，老年模型组MDA、LDH 的含量升高，SOD的活性降低(P<0.05)；与老年模型组相比，除Cor低剂量组差异无统计学意义外，Cor中、高剂量组MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高(P<0.05)，见表3。提示Cor能够缓解心脏组织氧化应激反应。

表3 Cor对老年大鼠心脏组织氧化应激指标的影响

2.5 Cor对老年大鼠心肌细胞凋亡的影响青年对照组正常心肌细胞核呈淡蓝色；老年模型组心肌细胞核偏褐色，染色质积聚成致密的团块，胞质有部分黄染，提示有大量凋亡细胞；与老年模型组相比，Cor各给药组细胞凋亡减少，见图2。提示Cor缓解老年大鼠心肌细胞的凋亡。

图2 Cor对老年大鼠心肌细胞凋亡的影响 ×200A:青年对照组；B：老年模型组；C：Cor低剂量组；D：Cor中剂量组；E：Cor高剂量组

2.6 Cor对老年大鼠心肌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响与青年对照组相比，老年模型组cleaved Caspase 9/Caspase9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表达升高(P<0.05)；与老年模型组相比，除Cor低剂量组差异无统计学意义外，Cor中、高剂量组cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表达降低(P<0.05)，见图3。提示Cor能够抑制老年大鼠心肌细胞凋亡，缓解心脏功能损伤，与2.5项结果一致。

图3 Cor对老年大鼠心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响A：青年对照组；B：老年模型组；C：Cor低剂量组；D：Cor中剂量组；E：Cor高剂量组；与青年对照组比较：*P<0.05；与老年模型组比较：#P<0.05

2.7 Cor对老年大鼠心肌细胞中Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达的影响与青年对照组相比，老年模型组p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表达降低(P<0.05)；与老年模型组相比，Cor中、高剂量组p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表达升高(P<0.05)，见图4。提示Cor对老年大鼠心脏功能具有保护作用，其机制可能与促进Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达有关。

图4 Cor对老年大鼠心肌细胞Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达的影响A：青年对照组；B：老年模型组；C：Cor低剂量组；D：Cor中剂量组；E：Cor高剂量组；与青年对照组比较：*P<0.05；与老年模型组比较：#P<0.05

3 讨论

Cor在治疗人类疾病中具有良好的药用潜力。其中，Cao et al[8]的研究显示，Cor通过体内外自噬诱导对糖尿病肾病有良好的治疗效果；Han et al[9]的报道表明，Cor通过调节炎症、凋亡和氧化应激作用缓解肾脏缺血损伤；Wang et al[10]的研究指出，Cor通过激活AMPKα通路改善心肌肥厚程度。本研究结果显示，Cor干预治疗后HR、LVEF、FS的水平升高；细胞排列紊乱、肿胀、坏死，肌纤维自溶、断裂的现象减轻； CK-Mb、Mb、cTnI 的水平降低。实验提示，Cor能够缓解心脏功能指标的降低，在一定程度上改善心脏收缩、舒张功能；能够降低心脏功能损伤标记物水平；能够缓解组织结构的紊乱和病变，改善心肌细胞损伤。

细胞氧化应激会引起蛋白质损伤、脂质紊乱、DNA突变等有害的生化反应。其中，SOD在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用，但随着年龄的增长，体内SOD的含量呈下降趋势，增长的自由基会破坏机体的平衡，使机体产生各种疾病[11]。MDA是脂质过氧化的产物，其含量反映组织过氧化的程度[12]。LDH主要存在于胞质内，不能通过细胞膜，当细胞受损或凋亡时才被释放，因此，LDH水平与细胞凋亡程度成正相关。本研究结果显示，Cor干预治疗后MDA、LDH 的含量降低，SOD的活性升高，提示Cor能够缓解心脏组织氧化应激反应。

细胞凋亡具有调控细胞衰老和程序性死亡的效应，可及时清除机体内多余和受损伤的细胞，维持组织器官的稳定性。细胞凋亡主要由Caspase蛋白酶家族所调控，当细胞接收到刺激信息，促进凋亡小体的生成，通过自我剪切方式活化Caspase 9，Caspase 9进一步对下游Caspase 3进行活化。活化的Caspase 3可促使相关蛋白表达，cleaved Caspase 3进一步破坏细胞骨架及管家基因的功能，影响正常细胞信号的传递、周期的调控，使细胞出现核凝结、核裂解等凋亡形态学上的改变。本研究结果显示，Cor干预治疗后cleaved Caspase 9/Caspase 9、cleaved Caspase 3/Caspase 3的表达降低，提示Cor能够抑制老年大鼠心肌细胞凋亡，缓解心脏功能损伤。

Nrf2是一种抗氧化转录因子，当机体受到不利刺激时，启动下游HO-1、NQO1及SOD等抗氧化基因的转录。HO-1在体内具有抗氧化、细胞保护作用，可清除氧自由基，阻止脂质过氧化。Cor通过Nrf2/HO-1途径缓解脂多糖诱导的急性肺损伤[13]；通过Nrf2和AMPK抑制细胞衰老，进而达到预防辐射溃疡的作用[14]；通过Nrf2/HO-1/NF-κB通路发挥抗肝癌的作用[15]。本研究结果显示，Cor干预治疗后p-Nrf2/Nrf2、NQO1、HO-1的表达升高，提示Cor对老年大鼠心脏功能具有保护作用，其机制可能与促进Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达有关。

综上所述，Cor能够改善老年大鼠心脏功能，缓解氧化应激反应，抑制心肌细胞凋亡，对大鼠心脏组织损伤具有一定的保护作用，其机制可能与促进Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达有关。