miR-1250-3p 对肝细胞癌细胞侵袭迁移能力的影响及其作用机制

刘文靓 徐倩 廖肇忠 巩遵双 华君男 王喆 蒲明怡 李宁

(1 青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学系，山东 青岛 266071； 2 青岛大学基础医学院)

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球较为普遍的癌症之一，是癌症相关死亡的主要原因之一[1-2]。对于早期和中期患者临床上仍然以手术治疗为主，但仍具有较高的复发率且患者的预后不良[3-5]。近几十年来，对于HCC药物治疗的研究已十分深入，但耐药性是导致治疗失败的主要原因[6-7]。因此，探索HCC发生和进展的潜在机制，寻找新的药物靶点，是改善HCC患者预后的有效手段。

microRNA(简称miRNA)是天然存在的小非编码RNA分子，通过降解mRNA或阻断翻译启动来控制转录后基因表达，参与细胞的增殖、分化和凋亡等过程[8-9]。最近，多项研究显示miRNA可以通过对癌基因或者抑癌基因的表观调控参与HCC的发生发展过程[10-12]。miR-1250是最新鉴定的一类miRNA，定位于凋亡相关酪氨酸激酶基因(AATK)的第2个内含子区[13]。研究发现，miR-1250在口腔鳞状细胞癌、食管鳞癌中表达下调，提示其可能作为抑癌基因，减少细胞的侵袭和转移[14-15]。miR-1250-3p是miR-1250家族中的一员，其功能未知。

Eva-1 同源物 A (EVA1A)基因，也被称之为FAM176A或TMEM166，是近年来鉴定出的参与调节自噬和细胞凋亡的基因，定位于溶酶体和内质网中[16-18]。前期研究发现，EVA1A蛋白在人HCC组织和细胞系中的表达水平显著降低，EVA1A过表达能明显诱导细胞凋亡，同时抑制HCC细胞的增殖、迁移[19-20]；miR-103a-3p通过抑制EVA1A促进Hccl-M3的迁移[21]。另有研究表明，miR-125b 通过直接抑制EVA1A来抑制细胞增殖、迁移以及上皮间质转化，从而逆转了HCC中的奥沙利铂耐药性[22]，这表明EVA1A在HCC中受miRNAs的靶向调控。然而EVA1A是否受miR-1250-3p靶向调节进而影响HCC细胞的侵袭和迁移目前尚不清楚。本研究旨在初步探讨miR-1250-3p对HCC细胞侵袭以及迁移的影响及作用机制，以进一步寻找HCC新的药物靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常肝细胞L02和人HCC细胞系QGY-7703、PLC/PRF/5、HccL-M3以及293T细胞均由青岛大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室提供。

1.2 试剂与仪器

DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)，青链霉素混合液、胰蛋白酶消化液(北京索莱宝生物科技有限公司)，Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)，miR-1250-3p mimics、miR-1250-3p inhibitor及其阴性对照(上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，U6、miR-1250-3p引物(上海生工生物工程有限公司)，RIPA蛋白裂解液(碧云天生物技术有限公司)，全波长多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)，兔抗人EVA1A抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体(武汉三鹰生物生物技术公司)，Trizol RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)，荧光定量PCR试剂盒、RNA逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物技术有限公司)。

1.3 细胞培养

将各细胞系细胞接种于含体积分数0.01链霉素溶液和体积分数0.10胎牛血清的高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的无菌恒温培养箱内培养至对数生长期，且适宜密度时用于后续实验。

1.4 研究方法

1.4.1RT-qPCR检测miR-1250-3p mRNA表达情况 以TRIZOL法提取各组细胞总RNA，分别测定RNA纯度与浓度，其中引物序列见表1。以U6作为内参对照，逆转录为cDNA并进行RT-qPCR。每个样品设5个复孔，重复3次。使用2-△△CT公式计算miR-1250-3p的相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.2Western blot方法检测EVA1A的相对表达量 取生长状态良好、对数生长期的QGY-7703细胞每孔2×105个细胞接种于6孔板中。待细胞密度达到50%～60%时，A、B、C及D各组分别转染mimics NC、mimics miR-1250-3p、inhibitor NC以及miR-1250-3p inhibitor,转染72 h后，吸弃培养基，用PBS洗涤3次，采用含体积分数0.01 PMSF的裂解液裂解提取胞内总蛋白。检测蛋白浓度后，加入5×Loading buffer煮沸10 min使蛋白变性后，分装，-80℃储存。配制相应浓度SDS-PAGE分离胶及浓缩胶，电泳、转膜，使用TBST配制的体积分数为0.05的BSA室温封闭膜2～3 h，以β-actin作为内参蛋白，使用兔抗人EVA1A一抗按照1∶500的比例稀释后4 ℃孵育膜过夜。次日应用TBST洗膜，用相应的二抗孵育1～2 h，再次洗膜后显影，最后使用Image J软件分析目的条带EVA1A以及内参β-actin灰度值，以EVA1A/β-actin灰度值表示相对表达水平，实验重复3次并计算均值。

1.4.3双荧光素酶报告基因活性的检测及其分析分别构建EVA1A-3′UTR-wt和EVA1A-3′UTR-mu。将293T细胞分为G、H、I、J组接种于6孔板之中，待细胞密度达到40%～60%时各组分别转染EVA1A-3′UTR-wt+mimics NC、EVA1A-3′UTR-wt+mimics miR-1250-3p、EVA1A-3′UTR-mu+mimics NC、EVA1A-3′UTR-mu+miR-1250-3p mimics；48 h后吸弃培养基，用PBS洗涤数次，用上述裂解液裂解细胞后移至96孔板中，每孔加100 μL的1×PLB，吹打混匀置于室温摇床上裂解15 min后移至EP管中，4 ℃下以10 000 r/min离心15 min，弃沉淀取上清液；每孔加100 μL Lucife-rase Assay ReagentⅡ吹打混匀以后测定内参值(萤火虫荧光素酶检测值，Firefly luciferase)；最后加入100 μL终止液，吹打混匀数次以后，检测报告基因发光值(海肾荧光素酶检测值，Renilla luciferase)。相对荧光素酶活性以Renilla luciferase值/Firefly luciferase值表示。实验重复3次取均值。

1.4.4细胞划痕实验检测HCC细胞系QGY-7703的迁移能力 取生长状态良好、处于对数生长期的QGY-7703细胞接种于6孔板之中，密度为每孔约5×105个细胞。A、B、C、D、E、F细胞密度达到50%～60%时，A、B、C、D组转染过程同上述操作，E、F组细胞分别转染Myc-EVA1A+mimics miR-1250-3p、Myc-EVA1A。转染后的细胞继续于培养箱中培养，待细胞融合度达到85%时进行划痕实验，于0、24、48 h分别观察细胞迁移情况并拍照，以Image J软件计算划痕面积。实验重复3次，实验结果取均值。

1.4.5Transwell实验检测HCC细胞系QGY-7703的侵袭能力 转染后36 h，将上述A、B、E 3个组的细胞(即分别转染mimics NC、mimics miR-1250-3p与共转染)按照试剂盒说明书要求，配置基质胶并均匀铺在上室待其凝固，加入无血清培养基混悬的细胞约2×104个每孔，下室加入600 μL完全培养基，继续培养24 h直至下室中有细胞掉落。弃上室培养基后PBS洗2次，甲醇固定后用蒸馏水配制体积分数为0.001的结晶紫溶液染色，再用PBS清洗，自然风干后显微镜下拍照。

2 结 果

2.1 HCC各细胞系以及L02细胞中miR-1250-3p mRNA表达水平

RT-qPCR结果表明，永生化肝细胞L02以及QGY-7703、PLC/PR/5、HccL-M3中miR-1250-3p mRNA平均相对表达量分别为2.53±0.37、16.68±0.32、6.48±0.25、23.55±0.84，差异均有统计学意义(F=155.50，P<0.05)。

2.2 各组QGY-7703细胞EVA1A蛋白表达水平

Western blot结果表明，A～D组的QGY-7703细胞中EVA1A蛋白相对表达水平分别为0.87±0.17、0.54±0.10、0.83±0.15、1.27±0.12，组间比较差异有显著性(F=44.91，P<0.05)；B组较A组细胞中EVA1A蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)；D组较C组细胞中EVA1A蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)，其余两组间比较差异无显著统计学意义(P>0.05)。见图1。

A～D分别为A～D组

2.3 双荧光素酶活性分析结果

EVA1A-3′UTR-wt和EVA1A-3′UTR-mu荧光素酶均报告基因质粒构建成功(图2)。检测结果显示，G～J组荧光素酶活性分别为0.99±0.03、0.69±0.02、0.99±0.01、0.98±0.01，组间比较具有显著差异性(F=168.28，P<0.05)；H与G组相比，荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，表明EVA1A是miR-1250-3p的下游靶基因。

图2 EVA1A-3′UTR-wt及EVA1A-3′UTR-mu miR-1250-3p结合位点图

2.4 miR-1250-3p表达对QGY-7703细胞迁移的影响

析因设计的方差分析表明，时间、组别及其交互作用均对QGY-7703迁移率具有明显影响(F组别=335.14，F时间=287.53，F时间*组别=135.26，P<0.05)。单独效应结果显示，随着培养时间的延长，A～F组QGY-7703细胞的迁移率明显增高(F=23.58～173.51，P<0.05)；第24、48小时A～F组细胞迁移率比较差异有显著性(F=192.73、108.56，P<0.05)。两两比较结果显示，B组在第24、48小时的迁移率均高于A组(P<0.05)，E组高于F组(P<0.05)，D组低于C组(P<0.05)，E组低于B组(P<0.05)，其他任意两组间比较均无统计学差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组QGY-7703细胞迁移率比较

2.5 miR-1250-3p表达对QGY-7703细胞侵袭的影响

Transwell结果表明，A、B、E组细胞侵袭数量分别为(67.67±2.35)、(229.67±4.05)、(156.67±3.74)个，三组间比较差异具有显著性(F=44.48，P<0.05)；其中B组细胞侵袭能力明显高于其他两组(P<0.05)。见图3。

A、B、C分别为A、B、E组

3 讨 论

HCC是癌症死亡的第三大原因，仅次于肺癌和胃癌[23-24]。miRNA在各种恶性肿瘤中发挥抑癌或者促癌作用[25-27]，因此探索miRNA介导的HCC发生发展的具体机制可能会改善HCC患者的预后情况，对于确定有效干预HCC的新型分子靶点至关重要。

目前对于miR-1250在癌症中的作用研究甚少。仅有少数的研究结果显示，与正常组织相比，miR-1250在口腔癌和食管鳞状细胞癌中被下调，miR-1250的低表达与食管鳞状细胞癌的转移性疾病、组织学低分化和晚期TNM分期有关[14-15]。此外，miR-1250-5p是一种在非霍奇金淋巴瘤中高度甲基化的新型肿瘤抑癌miRNA，可以抑制细胞的迁移[28]。本研究首次探讨了miR-1250-3p在HCC中的功能。通过比较miR-1250-3p在正常肝细胞L02以及HCC细胞系中的表达发现，其在HCC细胞系中的表达均明显高于正常肝细胞。本研究划痕实验及Transwell实验结果表明，上调miR-1250-3p表达可促进HCC细胞侵袭、迁移。而采用双荧光素酶实验证实，EVA1A是miR-1250-3p的下游靶基因，并通过EVA1A的回补实验证实miR-1250-3p通过靶向下调EVA1A表达促进HCC细胞的侵袭、迁移。本研究结论为miR-1250-3p在肝细胞癌中发挥促癌功能，而miR-1250-5p在非霍奇金淋巴瘤中是一种抑癌miRNA，可见miR-1250家族可能在不同的肿瘤中发挥不同的功能。

EVA1A是近年来发现的一种可以调节自噬和凋亡的新型内质网和溶酶体相关蛋白。EVA1A的表达具有细胞和组织特异性，并在多种恶性肿瘤中的表达显著降低，表明其可能调控这些肿瘤的发生发展过程[18,29-32]。另外有研究发现，miR-125b通过靶向下调EVA1A从而增加HCC细胞的化疗敏感性，提示在HCC中，某些miRNAs具有靶向调节EVA1A克服化疗耐药性的潜在应用[22]。本研究结果显示，miR-1250-3p是EVA1A的上游调控miRNAs之一，其在HCC细胞中靶向下调EVA1A，促进了HCC细胞的侵袭和迁移，说明EVA1A具有很多上游调控因子，在不同的生理病理环境中被不同的miRNA调控，发挥不同的功能。

恶性肿瘤的标志之一是血管生成。新生成的血管网络可以从肿瘤微环境中去除代谢废物和二氧化碳，促进肿瘤的扩散和转移[33-35]。一些miRNA还是血管生成的调节剂，发挥促进或抑制血管生成的作用[36]。有研究结果显示，miR-211-5p、miR-497、miR-125a等可通过靶向VEGF促进HCC细胞的增殖、迁移和血管生成[37-39]。但是miR-1250-3p作为miR-1250家族一员，是否影响血管生成进而影响HCC细胞迁移尚不清楚。

综上所述，本研究首次证实了miR-1250-3p通过靶向下调EVA1A促进HCC细胞的侵袭以及迁移。结合前期研究发现，EVA1A能够通过上调TP53抑制肝癌细胞的侵袭、迁移以及增殖[20]，因此，miR-1250-3p-EVA1A-TP53可能是调控HCC细胞侵袭和迁移的重要通路；肿瘤血管生成对肿瘤的生长、扩散、转移都有重要作用，miR-1250-3p是否可以促进肿瘤血管生成从而促进HCC的发生发展，也需要后续进一步研究。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：刘文靓、徐倩、廖肇忠、巩遵双参与了研究设计；刘文靓、华君男、王喆、蒲明怡、李宁参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byLIUWenjing,XUQian,LIAOZhaozhong, andGONGZunshuang. The manuscript was drafted and revised byLIUWenjing,HUAJunnan,WANGZhe,PUMingyi, andLINing. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.