KIF11在结直肠癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后的关系

王璐 陈阳 乔业华 张翔雁 邢晓明

(1 青岛大学基础医学院病理学系，山东 青岛 266021； 2 青岛大学附属医院病理科)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在全球常见癌症和常见癌症死亡原因中分别位列第3、第4位，发病率占所有癌症患者的10.2%，病死率占所有癌症患者的9.2%[1]。早期筛查的普及和确诊后的靶向治疗可有效降低CRC的发病率及病死率，但根据全球癌症统计报告显示，在2018年仍大约有180万新增CRC患者以及88万死亡患者[2]。因此，研究CRC发生发展的分子机制，寻找诊断与治疗的分子靶向标记物对提高CRC患者临床疗效和降低病死率具有重要意义。 驱动蛋白是调控细胞分裂及细胞内囊泡和细胞器运输的关键蛋白，驱动蛋白家庭成员11(KIF11)是驱动蛋白家族成员之一，属于N-2型有丝分裂驱动蛋白。KIF11是双极纺锤体形成过程中分离重复中心体所必需的关键成分[3-6]，其由1 057个氨基酸残基组成，由位于10q24.1的KIF11基因编码[7-9]。研究表明，KIF11基因在口腔癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等多种肿瘤组织中高表达，可促进相关肿瘤的发生和发展[10-16]。目前驱动蛋白家族与肿瘤的相关性研究越来越深入，但是关于KIF11在CRC组织当中的表达与作用鲜有报道[17-20]。有研究采用免疫印迹实验及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测KIF11基因在CRC组织中的表达水平[17]。本研究采用免疫组织化学方法(IHC)检测KIF11在CRC组织中的表达情况，进而分析其表达水平与患者临床病理特征及预后关系，探讨KIF11在CRC发生发展中的作用机制。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

收集2015年4月—2016年4月于青岛大学附属医院行手术切除的380例CRC患者的肿瘤组织及相应的癌旁(距肿瘤边缘>5 cm)正常组织样本。患者男230例，女150例；年龄28～91岁，平均为(64.3±0.6)岁。所有患者临床病理资料完整，且术前均未接受放化疗治疗。电话随访所有患者生存状态、生存时间以及肿瘤复发情况等指标，随访截至2018年5月31日。临床病理分期依据美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)制定的TNM分期系统(第8版)。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准(QYFYWZLL26608)。

1.2 实验试剂

KIF11兔抗人多克隆抗体(ab61199)购自于美国Abcam公司；羊抗兔抗体(A0545)购自于美国Sigma公司，工作浓度为1∶200；PV-6000 IHC检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1组织芯片制备 由两名专业病理医师对苏木精-伊红(HE)染色组织切片阅片，显微镜下观察并标记代表性区域，使用组织仪制作孔径为2.0 mm的CRC组织芯片，连续4 μm厚切片。

1.3.2IHC染色 组织芯片经脱蜡、水化后进行过氧化物酶阻断，高压修复法进行抗原修复(枸橼酸盐pH 6.0)，滴加浓度为1∶500的KIF11兔抗人多克隆抗体；同时将不加KIF11一抗的PBS作为阴性对照，4 ℃孵育过夜；滴加羊抗兔抗体二抗，室温孵育30 min；DAB显色，使用苏木精进行复染。

1.3.3IHC结果判读 由两名资深病理科医师在未知肿瘤级别情况下进行双盲阅片，显微镜下观察，以细胞质或细胞核中呈棕黄色或棕褐色染色为阳性表达。按照着色强度进行计分：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分[21]。根据IHC评分标准将380例CRC组织样本分为KIF11高表达组(≥2分)和KIF11低表达组(<2分)。

1.4 统计学处理

使用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。KIF11蛋白表达水平与CRC患者临床病理特征的关系采用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier法及Log rank检验；采用Cox比例风险回归模型对影响患者术后生存时间的因素进行单因素和多因素分析。并使用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制KIF11的表达水平与CRC患者预后的生存曲线。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CRC患者肿瘤组织及癌旁正常组织中KIF11蛋白表达水平

IHC染色结果显示，KIF11在癌旁正常组织中呈弱阳性表达或不表达(图1A)，在CRC组织中呈高表达(图1B)。所有样本中，126例(33.16%)肿瘤组织样本中KIF11呈高表达，12例(3.16%)癌旁正常组织样本中KIF11呈高表达，两者比较差异有统计学意义(χ2=382.956，P<0.05)。

A：癌旁正常组织，B：肿瘤组织，100倍

2.2 CRC患者肿瘤组织中KIF11的表达水平与临床病理特征的相关性

KIF11的表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移以及浸润深度有关(χ2=4.018～11.334，P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、是否远处转移等无关(P>0.05)。见表1。

表1 CRC患者肿瘤组织中KIF11表达水平与临床病理特征的关系[例(χ/%)]

2.3 CRC患者KIF11表达水平与术后生存的关系

根据随访结果绘制患者的Kaplan-Meier生存曲线，结果显示，KIF11低表达组和KIF11高表达组患者的总生存期(OS)分别为(49.862±0.511)、(49.146±1.216)月，无病生存期(DFS)分别为(49.688±0.553)、(46.331±1.183)月，KIF11低表达组和KIF11高表达组的生存比例分别为93.3%、84.1%，两组患者的上述预后指标比较差异均具有统计学意义(χ2=6.470～8.254，P<0.05)。见图2A、B。

A：OS，B：DFS

2.4 CRC患者预后的影响因素分析

进一步对CRC患者预后进行Cox单因素回归模型分析，其中二分类及多分类自变量赋值如下：KIF11表达水平(低表达组=参照)；淋巴结转移(M0=参照)；TNM分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2，Ⅳ期=3)，浸润深度(T1=0，T2=1，T3=2，T4=3)。单因素分析结果显示，肿瘤组织中KIF11表达水平和肿瘤浸润深度为影响CRC患者OS与DFS的危险因素(P<0.05)。再进行多因素分析结果显示，KIF11的表达水平和肿瘤浸润深度为影响CRC患者OS和DFS的独立危险因素(P<0.05)。详见表2、3。

表2 CRC患者OS影响因素分析

表3 CRC患者DFS的影响因素分析

3 讨 论

CRC是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年约有90万人死于CRC。新辅助放化疗、免疫治疗及靶向治疗等治疗方案能够使CRC患者术后总体生存率显著增高。但目前医学界对于CRC进展的分子机制研究尚未十分深入，因此进一步研究CRC进展的分子机制对降低晚期CRC患者的病死率具有重要意义。

KIF11是在非洲爪蟾体内提取并鉴定出的一种与有丝分裂纺锤体形成相关的驱动蛋白，是由头部马达结构域构成的同源四聚体，该马达结构域由340个氨基酸残基组成，包括ATPase位点及微管结合位点。KIF11可以交联两个相邻微管，使每个二聚体运动单元与单个微管相互作用。研究表明，细胞中的纺锤体位点会因药物干扰或KIF11的功能被抑制而激活，进而导致有丝分裂受阻，发生细胞凋亡，表明KIF11在有丝分裂过程中发挥重要作用[5,22]。另有研究表明，KIF11在有丝分裂开始时对中心体的迁移和稳定性必不可少，因此对双极中期纺锤体的形成也发挥着重要作用[3-4,23]。当驱动蛋白异常表达时，有丝分裂过程中会产生额外的外力致使姐妹染色单体过早分离和染色体分布不均，纺锤体形成异常，细胞分裂缺陷，从而导致细胞内遗传物质的分布发生改变，引起子代细胞众多功能异常,最终可能导致肿瘤发生[5]。

近年来大量研究证实，KIF11可通过调节有丝分裂过程中纺锤体的形成进而促进肿瘤细胞恶性生物学行为，包括细胞侵袭、转移、增殖及凋亡，其异常高表达与患者不良预后密切相关[16,24-26]。研究表明，KIF11基因在多种肿瘤组织及疾病中的表达均上调[26-29]。本研究采用IHC方法对CRC组织和癌旁正常组织中KIF11蛋白的表达情况进行分析，显示KIF11蛋白在CRC组织中表达上调，但在癌旁正常组织中呈低表达状态，由此可以推断KIF11基因与CRC的发生有一定相关性。有研究显示，KIF11基因可促进乳腺癌及肝癌患者癌细胞增殖，促进小鼠胰腺癌细胞增殖及肿瘤形成[11,13,15,29]。最近，有研究报道KIF11是CRC中最常见的失调性驱动蛋白之一，沉默KIF11基因则可以显著抑制CRC细胞增殖和肿瘤生长，提示KIF11基因可能是通过促进肿瘤细胞增殖过程进一步影响CRC的进展[17]。

本研究结果显示，KIF11蛋白的表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及肿瘤浸润深度显著相关。通过绘制CRC患者的Kaplan-Meier生存曲线分析显示，KIF11高表达组的CRC患者术后OS和DFS均短于低表达组，提示KIF11可能参与了CRC的侵袭与转移过程。进一步行单因素和多因素分析结果显示，KIF11高表达组患者的生存状态与KIF11低表达组患者的生存状态之间存在统计学差异，高表达KIF11的CRC患者生存比例显著低于低表达者。同样，KIF11的高表达水平和肿瘤浸润深度增加是影响CRC患者OS和DFS的独立危险因素。以上结果均表明KIF11的表达水平与CRC患者的发生发展及预后密切相关，KIF11高表达组患者可能更容易发生肿瘤的浸润和侵袭。总之，目前对于KIF11与CRC发生发展的具体分子机制研究甚少，有待于日后更深入的研究。

综上所述，KIF11在CRC组织中呈高表达，且与患者肿瘤TNM分期、淋巴结转移及肿瘤浸润深度密切相关，可能对CRC的发生发展和浸润转移发挥促进作用，KIF11基因有望成为CRC新的分子治疗靶点。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest: All authors disclose no relevant conflicts of interest.