铁调节蛋白2高表达对PC12细胞活力及铁调节蛋白1表达水平的影响

王淑华 贾凤菊 焦倩 傅琳 杜希恂 陈曦 姜宏

(青岛大学基础医学院，山东省神经相关疾病的机制与重点防治实验室，山东省沿海地区神经退变疾病协同创新中心，山东 青岛 266071)

细胞铁稳态是指细胞内铁浓度维持动态平衡，铁含量过多或过少都可能导致细胞损伤[1-2]。铁稳态的调节主要依赖于铁调节蛋白(IRPs)，IRPs分为IRP1和IRP2两种。研究发现IRP1主要与肾脏和肺组织特定细胞中的铁反应元件(IRE)结合，IRP1基因敲除(IRP1-/-)小鼠则会出现红细胞增多症和肺动脉高压[3]；IRP2也可以与细胞中铁转运和储存蛋白的IRE结构结合而发挥调节铁代谢的作用[4]，IRP2基因敲除(IRP2-/-)小鼠会出现贫血、铁稳态失衡并且带有神经退行性疾病症状(如姿势异常、尾巴僵硬、步态不协调等)[5-6]。另外，IRP1-/-并IRP2-/-小鼠在胚胎期即可死亡[7]。研究发现，将IRP2高表达的人肺癌细胞H1299注射到裸鼠皮下，可通过调节铁代谢促进肿瘤生长[8]，但IRP2高表达对神经元细胞活力的影响目前尚无报道。

既往的研究结果表明，IRP2-/-小鼠中IRP1代偿性表达增加[9]，但同时也有研究报道结果显示，IRP2和IRP1在各类癌细胞中的表达水平并不一致[10-11]。在MDA-MB-231乳腺癌细胞中IRP1以及IRP2蛋白的表达水平均显示呈显著性升高，但是在MDA-MB-175乳腺癌细胞中IRP1和IRP2蛋白的表达水平却呈现相反的趋势[12]。在神经退行性疾病当中，IRP2高表达对IRP1蛋白表达水平的影响并不明确，本研究旨在进一步探讨高表达的IRP2对PC12细胞存活率以及细胞中IRP1蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料来源

PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究所；Vector空载质粒购自和元生物技术(上海)股份有限公司；MYC-IRP2质粒由实验室前期构建； Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；MTT Formazan试剂盒购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒(Protein Assay Kit)购自江苏康为世界生物科技有限公司；IRP1抗体和IRP2抗体购自美国Abcam公司；GAPDH抗体购自美国CST公司；羊抗兔IgG-HRP购自上海爱必信生科科技有限公司。

1.2 PC12细胞培养

将含有PC12细胞的冻存管从液氮罐取出后立即转移到37 ℃水浴锅中至完全融化，吸取冻存管中的PC12细胞悬液并转移到含有5 mL完全培养基(DMEM培养基+体积分数0.10胎牛血清+体积分数0.01青链霉素混合液)的离心管中。然后用吸管吹打混匀后以1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液。再次与5 mL完全培养基混匀，接种到培养瓶中，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养。每2～3 d传代1次，传到第3代且细胞融合度达到90%时进行下一步实验。

1.3 细胞转染及分组

将培养好的细胞分别接种于96孔板(每组各设置5个复孔，用于MTT实验)和12孔板(每组各设置3个复孔，用于免疫印迹分析)中，在细胞密度达到60%～70%时进行质粒转染。转染MYC-Vector空载质粒的细胞设为Vector组，转染MYC-IRP2质粒的细胞设为IRP2组。分别将MYC-Vector空载质粒、MYC-IRP2质粒、Lip 2000与DMEM培养基混合，静置5 min后将MYC-Vector空载质粒混合物及MYC-IRP2质粒混合物分别与Lip 2000混合物吹打混匀，静置15～20 min后加到96孔板和12孔板的PC12细胞中转染。细胞转染6～8 h后观察细胞形态，细胞有变圆趋势时将培养液换成完全培养基。转染48 h后根据实验目的进行后面的MTT实验或免疫印迹实验。

1.4 MTT法检测PC12细胞存活率

弃掉96孔板中的培养基，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，在培养箱中避光孵育4 h；弃上清液后，每孔均加入DMSO 100 μL，室温下避光孵育10 min后；使用酶标仪检测各孔在波长570 nm处的吸光度(A)值并进一步计算细胞存活率，细胞存活率(%)=AIRP2组/A对照组×100%。

1.5 免疫印迹法检测PC12细胞中IRP2及IRP1的表达水平

对培养在12孔板中的Vector组和IRP2组细胞进行蛋白提取，使用BCA法检测并计算上样量，Vector组和IRP2组每个蛋白样品的上样量均为20 μg，然后加入5×上样缓冲液混匀以后，金属浴10 min以后进行SDS-PAGE凝胶电泳。然后以300 mA稳定电流转膜90 min，以含体积分数0.10脱脂奶粉室温封闭2 h，根据实验目的在每个条带分别对应加入IRP2、IRP1及GAPDH一抗4 ℃轻摇过夜。第2天于室温下以TBST洗膜3次，每次10 min。然后羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。最后用ECL发光液显影，并用Image J软件分析IRP2、IRP1和GAPDH条带的灰度值，IRP2、IRP1的相对表达水平以IRP2/GAPDH比值和IRP1/GAPDH比值表示。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 IRP2高表达对PC12细胞存活率的影响

Vector组和IRP2组PC12细胞存活率分别为(95.79±1.91)%和(81.71±2.98)%，与Vector组进行比较，IRP2组的细胞活力明显降低(t=3.97，P<0.01)。

2.2 IRP2高表达对PC12细胞中IRP1表达水平的影响

Vector组IRP1和IRP2蛋白的表达水平分别为0.88±0.05、0.55±0.04，IRP2组IRP1和IRP2蛋白的表达水平分别为1.24±0.13、0.84±0.09，两组比较，IRP1和IRP2蛋白的表达水平差异均具有显著性(t=2.59、3.01，P<0.05)。见图1。

A：两组细胞中IRP2表达水平，B：两组细胞中IRP1表达水平

3 讨 论

IRPs在靶基因5′mRNA与非翻译区的IRE结合，阻断翻译起始，或结合在靶基因3′mRNA附近，增强其稳定性[13]，从而影响调节铁代谢的靶蛋白，这些靶蛋白包括负责将铁转入细胞内的转铁蛋白受体1(TFR1)、二价金属离子转运体1(DMT1)、在细胞内储存铁的铁蛋白以及负责转出铁的铁转出蛋白(FPN)。当外源性给予三价或二价铁试剂处理导致细胞内高铁时，IRPs与IRE结合力减弱，FPN和铁蛋白表达增加，TFR1和DMT1表达减少，以降低胞内铁含量；当外源性加入铁螯合剂或诱导缺氧等因素诱导细胞内低铁时，IRPs与IRE结合力增强，铁蛋白与FPN表达减少，TFR1与DMT1表达增加以升高细胞内铁含量[14]。研究发现，IRP2是大脑中铁代谢的关键蛋白，可以调节铁的吸收与利用、血红蛋白的合成及影响氧气运输等，以直接或间接的方式参与肺癌、乳腺癌以及神经退行性疾病的发展过程[14]。研究显示IRP2与帕金森病(PD)有关，IRP2-/-小鼠TFR1和DMT1的表达水平明显降低，FPN和铁蛋白的表达水平增高，诱导黑质铁沉积，加剧多巴胺能神经元损伤，导致纹状体中多巴胺的释放减少，从而出现PD相关症状[15-17]。在肿瘤细胞中，IRP2也可通过调节铁代谢促进肿瘤细胞死亡[18]。因此，我们推测IRP-IRE系统是通过调控TFR1、DMT1、铁蛋白、FPN等铁代谢相关蛋白的表达影响PD的发生和发展[15]。

本研究结果显示，IRP2高表达后细胞存活率降低，说明IRP2的高表达对PC12细胞具有损伤作用，其损伤机制可能与IRP-IRE调节有关。一方面，IRP2表达上调后，IRP2与铁代谢相关基因上的IRE茎环结构结合，干扰细胞内铁稳态，进而导致细胞存活率降低。另一方面，IRP2还可以与抑癌基因P53、缺氧诱导因子[19]、影响肿瘤和神经系统功能的线粒体乌头酸酶[20]、影响血红素合成的δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶[21]等基因上的IRE茎环结构结合，影响这些基因的表达，可能对细胞的存活率产生影响，但作用机制仍需进一步的研究。

据报道，IRP1也可通过与IRE结合而影响铁代谢相关蛋白的表达，其机制与IRP2相似，这可能与两者同源性较高有关[13]，IRP1与IRP2有64%的氨基酸序列重叠[22-23]。但是两者在铁代谢的调节作用上存在差异，IRP2在铁充足的细胞中可通过泛素化降解调节铁代谢[22]，IRP1可以特别地结合铁硫簇感知细胞内铁水平，但调节铁稳态的能力相较IRP2弱[24]。本研究的实验结果显示，在PC12细胞中高表达IRP2后IRP1蛋白表达水平升高，提示IRP2高表达或可促进IRP1蛋白水平的表达。目前IRP1表达水平增高的作用并不明确，它可能起到保护细胞的作用，因为有研究表明在阿尔茨海默病的典型标志物——淀粉样前体蛋白(APP)的5′端的非翻译区亦存在IRE样RNA茎环，在人源神经细胞中IRP1可以选择性地与该茎环结构结合并抑制其翻译，减少细胞损伤，进而发挥神经保护的作用[25]。但也有研究指出，IRP1过表达可导致细胞铁代谢紊乱，进而导致铁分布异常[26]，有可能造成器官或机体损伤。因此，IRP1增多对细胞的作用仍需进一步的研究。本实验结果显示，在PC12细胞中，当IRP2蛋白水平升高时，IRP1蛋白表达水平亦增高。这与在乳腺癌肿瘤细胞中得到的结果一致，即IRP2高表达导致肿瘤细胞生长过快时，可引起IRP1高表达来发挥抑制肿瘤生长的作用[12]。也有研究发现，IRP2与IRP1蛋白的表达呈相反趋势，在IRP2-/-小鼠的小脑、前脑以及脑干细胞中IRP1水平升高。可能与IRP1能部分代偿IRP2的功能有关[9]，因为尽管IRP2对铁代谢相关蛋白的调节起主导作用，而IRP1可能相当于潜在的“替补部队”，来弥补IRP2的缺失以维持机体铁代谢稳定[9]。总之，IRP2与IRP1的关系并不明确，可能因细胞来源、在体或离体条件的不同而存在差异。

综上所述，IRP2高表达对PC12细胞具有损伤作用，同时IRP2高表达也可引起PC12细胞中的IRP1表达升高，本研究为进一步明确IRP2与IRP1的关系提供了实验依据，对阐明IRP2与IRP1在铁代谢紊乱相关疾病中的作用具有一定的科学意义。

利益冲突声明：所有作者声明不存在利益冲突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者贡献：王淑华、贾凤菊、陈曦、姜宏参与了实验设计；王淑华、焦倩、傅琳、杜希恂参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。

Contributions： The study was designed byWANGShuhua,JIAFengju,CHENXi, andJIANGHong. The manuscript was drafted and revised byWANGShuhua,JIAOQian,FULin, andDUXixun. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.