基于多种分析模式建立壮药材火索藤的HPLC 指纹图谱

刘 笑 ，李林杰 ，王昱涵 ，王志萍

（1.广西中医药大学药学院/中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 530200；2.广西卫生职业技术学院药学系，南宁 530023）

火索藤（Bauhinia aureaLevl.），又名牛蹄藤、红绒毛羊蹄甲、红毛藤、金叶羊蹄甲、合掌风、九龙藤、黄麻藤，壮药名“huha”（“愈合”之意），为豆科羊蹄甲属植物火索藤的根或茎，亦有全株入药的记载［1，2］。主要产自广西、贵州、云南等地［3，4］，是广西壮族自治区（简称广西）特色壮药材，在广西壮族民间有一定的使用历史。其性温，味微苦、涩，具有祛风除湿，通络止痛的功效，主治风湿性关节炎、鹤膝风、跌打损伤、肾炎、黄疸型肝炎等症［4，5］。国内外对火索藤的研究报道较少，主要是化学成分研究［6］，鲜见其质量评价方面的报道。火索藤在民间存在同名异物的情况，不同地区常出现用药混乱的现象，而该药又缺乏统一的质量标准，使得各地用药质量不一，临床疗效差异较大，因此，建立火索藤的质量控制方法十分必要。中药材指纹图谱是一种具有高度专属性的特征图谱，目前已被广泛应用于质量控制等方面。建立中药材指纹图谱不仅能较全面地反映药材所含成分的相互关系，而且还可以对不同批次药材进行准确区分，有效地鉴别药材的产地和真伪，可以较好地控制药材的质量，确保药材质量的稳定。本研究对火索藤进行HPLC 指纹图谱研究，建立不同产地火索藤甲醇提取物的HPLC 指纹图谱，并进行相似度评价、聚类分析和主成分分析，以期更好地对其质量进行评价和控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材 火索藤样品分别采自广西来宾市、岑溪市、梧州市、玉林市、河池市及南宁市等不同市县或乡镇，其中采自广西来宾市兴宾区天堂乡的火索藤经广西中医药大学生药学专家韦松基教授和广西中医药研究所黄云峰副研究员鉴定为豆科植物火索藤的带叶藤茎，编号HST-1，作为对照药材，并将其茎、叶、果荚制成腊叶标本。2～10 批按采收日期分别编号HST-2～HST-10。样品信息见表1。

表1 火索藤样品信息

1.1.2 试剂 色谱级乙腈、色谱级甲醇、分析纯甲醇、磷酸。

1.1.3 试药 表儿茶素（纯度99.82%，批号RP190620）对照品购自成都麦德生科技有限公司；金丝桃苷（纯度 98.49%，批号 MUST-20052210）、槲皮苷（纯度98.87%，批号MUST-20121401）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.1.4 仪器 SQP 型电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；FLBP-200 型万能高速粉碎机，上海菲力博食品机械有限公司；PL-FS40T 型超声波清洗机，东莞康士洁超声波科技有限公司；岛津LC-2030C 3D 型高效液相色谱仪（包括PAD 型检测器、LabSolution 工作站），日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 火索藤HPLC 指纹图谱方法的构建

1）供试品溶液的制备。取火索藤对照药材粉末（过2 号筛）1 g，精密称定，置于带塞锥形瓶中，精密量取25 mL 甲醇加入，称重，超声处理1 h，放凉后甲醇补足失重，摇匀，过滤。取滤液过0.45 μm 微孔滤膜。

2）混合对照品溶液的制备。精密称取表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.048、0.052、0.112 mg/mL 的混合对照品溶液。

3）色谱条件。色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸水；梯度洗脱：0～40 min，8%～16%乙腈；40～60 min，16%～18% 乙腈；60～65 min，18%～20% 乙腈；65～85 min，20%～28%乙腈；85～100 min，28%～40%乙腈；流速 1.0 mL/min；柱温 30 ℃；进样量10 μL；检测波长212 nm。

1.2.2 方法学考察

1）精密度试验。按照“1.2.1”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件连续重复进样6 次，测定并记录。

2）重复性试验。 取火索藤药材（批号20190726）6 份，按照“1.2.1”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件连续进样测定。

3）稳定性试验。按照“1.2.1”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件分别于 0、2、4、8、12、24 h 进样，测定并记录。

2 结果与分析

2.1 火索藤HPLC 指纹图谱的建立

按照“1.2.1”方法，得到火索藤甲醇提取液HPLC 指纹图谱。将混合对照品色谱图与火索藤的指纹图谱进行对比，比较二者的保留时间，可指认火索藤指纹图谱中的3、9、11 号峰分别为表儿茶素、金丝桃苷、槲皮苷（图1）。

图1 混合对照品（A）及火索藤供试品（B）的HPLC

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验 以11 号峰（槲皮苷）为参照，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD值为0.029%～0.131%，相对峰面积的RSD值为0.176%～0.811%，表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验 以11 号峰（槲皮苷）为参照，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD值为0.128%～0.587%，相对峰面积的RSD值为1.653%～2.986%，表明建立的方法重复性好。

2.2.3 稳定性试验 以11 号峰（槲皮苷）为参照，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD值为0.095%～0.348%，相对峰面积的RSD值为0.167%～2.963%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3 10 批火索藤HPLC 指纹图谱的建立

2.3.1 共有峰的确定 取10 批火索藤样品，按“1.2.1”方法制备供试品溶液，按“1.2.1”色谱条件进样测定，将10 批火索藤样品的色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”中进行色谱峰处理，采用中位数法，以0.1 min 为时间宽度，S1（HST-1）为参照图谱，选择分离度好、含量较大的11个色谱峰作为壮药火索藤的指纹图谱共有特征峰，经色谱图多点校正后自动匹配并生成对照指纹图谱R，得到10 批火索藤的指纹图谱（图2）。

图2 10 批火索藤HPLC 指纹图谱

2.3.2 相似度评价 在“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”中，选择“计算相似度”，系统则以生成的对照指纹图谱R 为对照，对10 批火索藤药材的指纹图谱进行相似度计算，HST-1～HST-10，相似度分别为0.974、0.939、0.958、0.907、0.986、0.986、0.932、0.938、0.969、0.969。10 批火索藤指纹图谱的相似度均在0.900 以上，表明广西不同产地火索藤的化学组成一致性较好。

以11 号峰（槲皮苷）为参照峰，分别计算10 批火索藤指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。10 批火索藤11 个共有峰的相对保留时间的RSD值为0.054%～0.349%，说明11 个共有峰的出峰时间较稳定，反映了不同产地不同批次火索藤的化学成分一致性好；相对峰面积的RSD值为36.885%～101.756%，表明不同产地不同批次火索藤的共有成分含量差异较大，猜测与土壤、气候的差异等因素有关。

2.4 聚类分析

采用SPSS21.0 统计软件，以11 个共有峰的峰面积数据为变量，以Ward 法作为聚类方法，以平方Euclidean 距离为度量标准，对10 批火索藤指纹图谱共有峰的峰面积进行聚类分析，结果见图3。

图3 10 批火索藤聚类分析

由图3 可知，欧氏距离为5.5 时，10 批火索藤样品可分为 4 类，第 1 类：HST-1、HST-5、HST-6；第 2类：HST-2、HST-3、HST-4、HST-9；第 3 类：HST-8；第4 类：HST-7、HST-10。聚为一类的样品可反映其在共有峰表达上的相似性。

2.5 主成分分析

运用SPSS21.0 统计软件，以11 个共有峰的峰面积数据为变量（Z 标准化后）进行主成分分析。主成分提取分析结果见表2。

表2 主成分解释的总方差

按照特征值大于1 的标准，抽取出2 个主成分，分别记作 PC1、PC2。PC1 的特征值为 7.770，PC2 的特征值为1.852，分别能解释70.634%、16.836%的总体变异度，2 个主成分的累计方差贡献率达87.470%，即涵盖了火索藤指纹图谱中87.470%的化学信息，表明这2 个主成分能够代表最初的11 个共有峰来分析与药材质量的相关性。

成分矩阵可以反映各原始因素与不同成分的相关程度。相关系数绝对值越大，说明该原始变量与这个提取因子关系更密切。共有峰主成分矩阵见表3。

表3 共有峰主成分矩阵

由表 3 可知，峰 2～峰 10 在 PC1 上有明显载荷，归属为PC1，因此PC1 主要反映了2～10 号色谱峰的信息，其中3 号峰为表儿茶素、9 号峰为金丝桃苷；而峰 1、峰11 在 PC2 上负荷较多，将其归属为 PC2，PC2集中反映1 号、11 号色谱峰的信息。由于PC1 的特征值与方差贡献最大，因此其变量的权重值在很大程度上可反映化学成分与药材质量的相关性。比较PC1 中各变量的权重值，大于0.8 的变量对应的峰为2～9 号峰，说明这8 个峰对药材质量影响较大。

主成分公因子表达式可由主成分系数矩阵计算而得，主成分系数矩阵见表4。主成分公因子表达式如下。

表4 主成分得分系数矩阵

PC1=-0.057×Z 峰 1+0.123×Z 峰 2+0.114×Z 峰 3+0.125×Z 峰 4+0.107×Z 峰 5+0.126×Z 峰 6+0.116×Z 峰7+0.120×Z 峰 8+0.127×Z 峰 9+0.095×Z 峰 10+0.035×Z峰11

PC2=0.451×Z 峰 1+0.102×Z 峰 2+0.164×Z 峰 3+0.080×Z 峰 4-0.169×Z 峰 5-0.015×Z 峰 6-0.153×Z 峰7+0.153×Z 峰 8-0.006×Z 峰 9-0.116×Z 峰 10+0.451×Z峰11

经计算可得到各批次主成分得分，再以2 个主成分所对应的方差贡献率占所提取主成分累计方差贡献率的比例为权重系数建立模型，计算各批次的综合得分（表 5），模型为 Y=70.634×PC1/87.470+16.836×PC2/87.470。

表5 各批次主成分得分及综合得分

由表5 可知，同一产地的PC1 与PC2 分值排名不一定相同，说明评价不同产地药材的质量应当结合各项指标进行综合评价，因此结合2 个主成分因子的综合评分，按分值高低排序得到10 批火索藤药材的综合排名为 HST-7＞HST-10＞HST-8＞HST-1＞HST-6＞HST-3＞HST-5＞HST-9＞HST-2 ＞ HST-4，将同个产地的分值平均后，可得到7 个不同产地火索藤质量的综合排名为南宁隆安＞来宾兴宾＞岑溪安平＞梧州龙圩＞河池东兰＞玉林北流＞玉林容县，其中采自南宁隆安的火索藤药材整体质量最好。

对各批次共有峰面积进行主成分分析后，根据各批次的PC1、PC2 得分，建立以PC1 得分为横坐标、PC2 得分为纵坐标的空间散点坐标系，得到10 批次火索藤的主成分空间得分（图4）。

图4 不同批次火索藤的主成分空间得分

由图 4 可知，2 个主成分可将 10 批药材分成 4 个类别，HST-1、HST-5、HST-6 为一类，HST-2、HST-3、HST-4、HST9 为一类，HST-8 聚为一类，HST-7、HST-10 聚为一类，与聚类分析结果一致。

3 小结与讨论

为了较全面控制火索藤的内在质量，应选择与药材药效相关的成分作为指标成分。通过查找相关文献发现，表儿茶素具抗氧化、降脂降糖、预防心血管疾病、抗炎、保护神经、抑菌等作用［7］，金丝桃苷具抗肝损伤、抗炎、抗菌、抗癌、抗血栓、抗氧化应激作用（抗炎、解痉、利尿、局部和中枢镇痛等）［8-10］，槲皮苷具抗炎镇痛作用，抗炎活性主要表现为对致炎性因子的抑制［11］，3 种成分均与火索藤的药效作用相关，故将其作为指纹图谱的指标性成分。本研究指认了指纹图谱中的3 种已知成分，表儿茶素（3 号峰）、金丝桃苷（9 号峰）和槲皮苷（11 号峰）。其中槲皮苷的含量较高，峰面积占总峰面积的比例适宜，故将槲皮苷色谱峰（11 号峰）作为参照峰（S）。

本研究建立了火索藤甲醇提取物的HPLC 指纹图谱，确定了11 个共有峰，指认了其中3 种成分；各批次火索藤的指纹图谱相似度均大于0.90，说明所建立的指纹图谱具有良好的稳定性和可控性；通过对不同批次火索藤进行聚类分析、主成分分析，找到对药材质量影响较大的8 个成分，并对不同批次、不同产地的火索藤进行了综合评价，可为其质量评价与控制提供依据。