洞庭湖区可培养细菌群落结构及其空间分布特征

孙 霞，刘 扬，王 芳，张 虎，毛淑敏，亓翠英

（1.山东江河湿地生态研究院，济南 271100；2.中国水利水电科学研究院，北京 100038；3.湖南百舸水利建设股份有限公司，长沙 410007）

洞庭湖是中国第二大淡水湖，既是长江中游重要的调蓄滞洪区和重要的淡水资源储备地，也是中国农副渔业重要的生产基地，是濒危珍稀物种的主要越冬栖息地，在维系长江中游水域生态平衡和保护生物多样性等方面发挥重要作用。近年来伴随洞庭湖流域社会经济快速发展，其水质下降明显，富营养化形势严峻，2017 年监测结果显示，全湖水质类别为Ⅳ类或Ⅴ类，甚至为劣Ⅴ类［1］，因此对洞庭湖实施生态环境保护及治理已刻不容缓。

微生物是湖泊生态系统中的重要组分，其数量大、种类多，参与湖泊生态 C、N、P、S 等重要元素的物质循环过程，在营养物质循环利用、能量流动、维持生态平衡、改善生态环境等方面承担着重要的角色［2，3］。有些细菌可以同时脱氮除磷［4，5］，还有些细菌可以吸收固定环境中的重金属离子［6］，在污水处理及抗重金属污染等方面发挥重要作用，因此，研究某一特定区域生态系统的细菌多样性有重要意义。

目前对湖泊生境中微生物多样性的研究，通常采用纯培养和免培养2 种方式。多位学者从太湖［7］、察尔汗盐湖［8］等生境中分离培养细菌，开展群落结构及多样性研究，并发现了大量新微生物种类。自20世纪90 年代以来，随着高通量测序技术的发展和基因组学方法的出现，用免培养方法研究湖泊中微生物多样性的报道日益增多［9-11］，运用免培养方法可以消除实验室培养条件的影响［12］，能比较准确地反映出环境微生物多样性信息，为湖泊微生物多样性的研究带来了较大便利。但是，目前免培养技术只能在较高的分类水平（门或类）描述群落组成［13］，而不能在属、种的分类水平上分析群落结构，所以只能比较宽泛地解释种群组成变化。另一方面，湖泊中的许多微生物以休眠状态存在［13］，用免培养的方式不能区分细胞活性的差异。因此要研究微生物在湖泊中的代谢机制，获得生态系统中的功能性菌种资源，仅通过免培养技术是远远不够的，还需要纯培养菌株，因此从湖泊生境中分离获得独特的菌株资源具有重要意义。

本研究以洞庭湖水体及沉积物中的细菌为研究对象，采用经典的分离培养方法，获得大量纯培养菌株，结合16S rRNA 基因序列比对，对洞庭湖区可培养细菌群落结构及空间分布进行分析，拟通过对洞庭湖区可培养细菌的调查，进一步了解其细菌资源现状，以期为洞庭湖的微生物资源保护、开发和应用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 样点描述

洞庭湖（28°44′N—29°35′N，111°53′E—113°05′E）位于湖南省北部、长江中下游荆江河段南岸，北纳松滋河、虎渡河、藕池河长江三口河道分泄的洪水，西南汇湘、资、沅、澧四水。东、南、西湖水面积约2 625 km2，湖盆周长为803.2 km，总容积约220亿m3。洞庭湖区采样点分布如图1 所示。

图1 洞庭湖区采样点分布

1.2 样品采集及物化参数的测定

本试验所用样品于2019 年8 月采集获得。根据洞庭湖的形态特征，分别在东、南、西洞庭湖选取6个点，采集水样和对应的表层沉积物（图1）。水样用有机玻璃采水器取样，浅水区直接取表层水样，深水区则取上、中、下层的混合水样。沉积物采集使用采泥器掘取表层沉积物，用无菌金属勺分装于无菌塑料袋内。水样及沉积物采集后储存于4 ℃保温箱中，尽快带回实验室进行操作。

采样点地理坐标利用GPS 仪测量，pH 值采用YSI 多参数水质分析仪原位测定，氨氮、总氮、总磷等参数的测定参照国家标准进行［14］。

1.3 综合营养状态指数计算

综合营养状态指数TLI（∑）计算公式为［15，16］：

式中，TLI（∑）为综合营养状态指数；Wj为第j种参数营养状态指数的相关权重；TLI（j）为第j种参数的营养状态指数。本研究选择叶绿素a 含量（Chla）、总氮（TN）、总磷（TP）3 个指标进行评价。贫营养TLI（∑）＜30；中营养 30≤TLI（∑）≤50；富营养TLI（∑）＞50；轻度富营养50＜TLI（∑）≤60；中度富营养60＜TLI（∑）≤70；重度富营养TLI（∑）＞70。

1.4 细菌菌株分离、纯化及鉴定

用于细菌分离的培养基组成（L-1）为蛋白胨5 g、酵母粉 1 g、葡萄糖 0.5 g、琼脂粉 18～20 g、洞庭湖水1 L、pH 7.0～7.5，灭菌20 min。

分离纯化试验具体操作如下：称取10 g 沉积物样品至 90 mL 灭菌洞庭湖水中，在 30℃、120 r/min 摇床摇匀20 min，静置 15 min，取上清液100 μL 至分离培养基，涂布，置于30 ℃恒温培养箱中培养2～5 d，挑取不同形态的单菌落，反复划线纯化至获得纯菌株。湖水样品分离，取100 μL 至分离培养基涂布，培养及纯化方法同沉积物样品。

菌种的鉴定采用PCR 扩增16S rRNA 基因并在基因库中进行BLAST 比对。菌株DNA 的提取及16S rRNA 基因扩增参照 Besaury 等［17］的方法，通用引 物 为 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京诺赛基因组研究中心进行测序。正反向测序拼接后获得约1 500 bp 的序列，通过BLAST 比对，分析该菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 洞庭湖上覆水及沉积物样品理化参数分析

分析水样及沉积物的理化性质可以了解微生物的生活环境，洞庭湖区各采样点的水质理化参数及综合营养状态评价结果如表1 所示，东、南、西洞庭湖的综合营养状态指数分别为43.77、46.26 和48.16，皆属于中营养水平，其中西洞庭湖区的营养化程度最高。通常Chla 的浓度代表湖泊中藻类含量，也是评价富营养化程度的重要指标，该研究显示，Chla 西＞Chla 南＞Chla 东，进一步说明西洞庭湖区的污染程度更高。上覆水中氨氮及总氮的空间分布规律为南洞庭＞西洞庭＞东洞庭，其中南、西洞庭水体总氮含量均超过Ⅴ类水标准，总氮污染较严重。各采样点总磷浓度在0.005～0.269 mg/L 波动，空间分布呈现 TP 东＞TP 西＞TP 南，东洞庭湖区总磷平均浓度为0.204 mg/L，超过Ⅴ类水标准。洞庭湖水域的pH 范围为6.91～7.24，呈中性偏碱性。

表1 采样点的水质理化参数及综合营养状态评价

洞庭湖东、南、西3 个湖区上覆水及沉积物的氮磷水平如图2 所示，东洞庭湖区上覆水中的氨氮、硝态氮、总氮含量和其他2 个湖区相比为最低，但其沉积物的氨氮、硝态氮、总氮含量为最高。东洞庭湖区上覆水和沉积物中总磷含量皆高于其他2 个湖区，说明东洞庭湖总磷污染整体较重。2017 年洞庭湖水质检测显示［1］，东洞庭湖水体中总磷含量高于其他2 个湖区，总氮含量低于西洞庭湖，高于南洞庭湖。有研究认为洞庭湖水体中的总氮和总磷主要来源于畜禽养殖、农田径流和城镇生活污染［18］，东洞庭湖区水体中氮水平的下降，原因可能是近几年岳阳市对东洞庭湖周边企业及环境进行了大力整治，但由于综合治理时间较短，在沉积物中总氮含量还未显示明显下降效果。

图2 洞庭湖上覆水和沉积物中的氮磷水平

2.2 洞庭湖区可培养细菌种群结构分析

从洞庭湖区共采集18 个水样、18 个表层沉积物样品，利用纯培养方法从水样和沉积物中分别获得细菌菌株49 株和45 株，通过16S rRNA 基因序列比对分析，合并相似性98%以上的菌株为同一个种，本次所分离获得的菌株归属于4 个门6 个纲10 个目12 个科17 个属41 个种。上覆水和沉积物样品在不同分类水平上菌群组成存在较大差异（表2），沉积物样品在分类水平上所包含的种类少于水样。

表2 洞庭湖上覆水和沉积物中细菌种群构成

从门水平来看，本研究从洞庭湖水样中分离的可培养细菌归属于4 个门，分别是变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria），其中变形菌门占所分离菌株数量的81.6%，是优势类群，其次是厚壁菌门，占12.2%，第三大类群是拟杆菌门，占4.1%，属于放线菌门类群的菌株最少，仅占2.1%。沉积物样品获得的45 株菌株归属于变形菌门和厚壁菌门，其中变形菌门是绝对优势类群，占分离物数量的89.5%，厚壁菌门类群占10.5%。

从属水平来看，从洞庭湖水体和沉积物中分离的可培养细菌隶属于17 个属，其中5 个属为二者共有，8个属为水样特有属，4个属为沉积物特有属（图3）。水样和沉积物样品优势属近似，分别是不动杆菌属（Acinetobacter）（34.7%、46.7%）、假单胞菌属（Pseudomonas）（18.4%、8.9%）、丛毛单胞菌属（Comamonas）（12.2%、13.3%）、芽孢杆菌属（Bacillus）（8.2%、15.6%），其他属分布较少（表3）。

图3 水样及沉积物样品中共有及特有属

洞庭湖东、南、西3 个湖区水样和沉积物中细菌属的分布也有差异（图4），其中从东洞庭水体中分离到8 个属，西洞庭分离到6 个属，南洞庭分离到5个属。3 个湖区水样中都分布的属是不动杆菌属和假单胞菌属，除此之外，东、南2 个湖区还有的共有属是丛毛单胞菌属，东、西2 个湖区还有的共有属是芽孢杆菌属，而西、南2 个湖区没有其他共有属。洞庭湖东、南、西湖区沉积物中分布的属分别为6、5 和4 个，3 个湖区沉积物中共有属为不动杆菌属和芽孢杆菌属，除此之外，东、南湖区还有的共有属为丛毛单胞菌属和假单胞菌属，西洞庭湖和东、南湖区皆没有其他共有属。

图4 洞庭湖3 个湖区水样和沉积物样品中可培养细菌组成（属水平）

3 小结与讨论

本研究从洞庭湖区采集的水样及沉积物样本中，通过纯培养方法分离获得94 株细菌，利用16S rRNA 基因测序方法将菌株鉴定到17 属41 种。本研究首次对洞庭湖区的可培养细菌做了较系统的研究，结果显示洞庭湖中存在丰富的细菌资源，且种群结构在空间分布上差异明显。上覆水中可培养细菌主要分布于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门，沉积物中可培养细菌主要分布于前2 个菌门。上覆水和沉积物中的优势类群都是变形菌门，优势属为不动杆菌属，东洞庭湖分布的细菌种类及丰度皆高于其他2 个湖区。变形菌门作为细菌中最大的主体，在湿地［19］、湖泊［9，20，21］及深海［22］等环境中都是优势类群，本研究表明在洞庭湖区也是优势菌门。不动杆菌属在洞庭湖水体和沉积物中皆是丰度最高的菌属，许多研究报道不动杆菌属在脱氮除磷中起重要作用［4，23］，是一类重要的反硝化聚磷菌，进一步说明洞庭湖区氮磷浓度较高，是微生物适应环境的结果，从而验证了细菌种群结构及丰度与环境因子之间的相关关系。

将3 个湖区的水质参数进行比较，南洞庭湖水体、东洞庭湖沉积物中总氮含量最高，东洞庭湖水体及沉积物中总磷含量最高。东、南、西3 个湖区的综合营养状态指数分别为43.77、46.26、48.16，皆处于中营养水平。2013 年对洞庭湖的研究表明［24］，西、南洞庭湖TLI（∑）平均为46.16、46.80，属于中营养水平，东洞庭湖TLI（∑）略大于50，属于轻度富营养水平。2017 年的调查结果显示［1］，东、南、西洞庭湖TLI（∑）平均为58.62、52.52 和53.83，都处于轻度富营养状态。本研究结果表明东洞庭湖的氮含量、叶绿素a 含量及综合营养状态指数，皆低于其他2 个湖区，分离的菌属种类也最多，表明东洞庭湖区的污染程度最低。整体来看，3 个湖区的营养状态指数皆有下降，说明近几年湖南省对洞庭湖的综合治理已见成效，且东洞庭湖区的治理效果更为显著。

一般而言，沉积物和上覆水2 种生境相比，沉积物中有更高的细菌群落多样性，因为与水体相比，沉积物中有更丰富的基质能充当微生物群落组成的非生物控制因素［25，26］，但是本研究从沉积物中分离的菌群种类及多样性低于水体，其原因有待进一步研究。此外，本研究所获得的细菌经16S rRNA 基因测序，有2 个菌株（DT-6-10、DT-16-3）与已知序列的同源性在97%以下，说明洞庭湖中存在大量可能为新种或新属的菌株，而且还筛选出多个具有较强脱氮除磷效果的菌株，部分已完成小试试验，结果在陆续整理中。因此在后续试验中，应不断优化培养基，改进分离培养方法，优化筛选条件，才能获得更多的微生物资源和功能性菌株，为微生物在各个领域的开发和应用提供基础材料。