基于GC-IMS和HS-SPME-GC-MS的不同处理方式分析黑枣挥发性成分

王 越，王 连，王 愈*

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

黑枣是枣果经高温熟化而形成的深加工产品。枣果营养丰富[1]，多糖类、氨基酸在加热的过程中极易发生美拉德反应[2]。张百刚[3]认为红枣中含有多酚氧化酶，在加工的过程中会发生酶促褐变，使枣果的色泽发生改变以及风味产生变化。近年来随着生活水平的快速提高，消费者对枣内在品质的要求越来越高，而风味是消费者最直观的选择依据，是评价其产品品质的重要指标，也能影响人们对食物食用口感好坏的一个关键因素[4]。枣果风味是由果实中大量的挥发性芳香物质混合而成，是枣果品质的重要组成部分[5]。挥发性有机化合物通常与食品风味有关，不同的处理方式会产生不同的挥发性有机化合物[6]。在红枣风味成分检测中多采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术，鲜见气相离子迁移谱（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）法在红枣风味成分检测中的应用。对枣果风味的研究集中在鲜枣[7-8]、干制枣[9]以及监控成熟过程中枣果特征风味物质的鉴定上[10]，对风味品质改善及工艺调控方式研究较少[11]。目前国内外对于黑枣的研究主要为工艺研究[12-15]。孙欣等[16]采用固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合GC-MS方法对高温高湿条件下成熟干制的黑枣样品进行挥发性成分分析，共检测出18种挥发性成分。宋建新[17]采用顶空（headspace，HS）-SPME-GC-MS联用仪、电子鼻和快速气相电子鼻等分析手段，研究枣果实成熟及干燥过程中的特征性香气。闫新焕等[18]利用SPME-GC-MS分析鉴定红枣片样品的香气成分及含量变化，3种不同干制方式处理的红枣样品的主要香味物质共有67种，其中酸类成分最多。刘莎莎等[19]采用HS-SPME-GC-MS分析检测6种不同品种红枣的香味物质，共检测出34种主要香味物质。但是，由于GC-IMS数据库限制，仍然存在一些物质无法直接定性[20]。本实验采用GC-IMS结合HS-SPME-GCMS技术，对不同处理方式下黑枣中各种风味物质的变化进行检测，分析风味物质与样品类型之间的关系，比较挥发性香气成分的差异，为黑枣加工褐变机制研究和工艺改进提供理论参考。同时进一步丰富黑枣特征风味物质的GC-IMS数据库信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山西太谷区半红期（着色率50%）壶瓶枣为原料，2020年9月5日采摘于山西省晋中市太谷区小白乡万亩枣园。选取无机械损伤、无病虫害的鲜枣，采收后均用打孔塑料袋包装，装箱运回山西农业大学食品科学与工程农产品贮藏与加工实验室，放置4 ℃冷库中备用。

甘氨酸 北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖 天津市北辰方正试剂有限公司；多酚氧化酶（1 560 U/mg）合肥博美生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Flavour Spec1H1-00053型GC-IMS联用仪 德国G.A.S公司；Trace 1300 GC-MS联用仪 美国Thermo公司；PR224ZH/E分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

根据Yu Hang等[21]的方法配制美拉德反应液。多酚氧化酶浓度为20 U/mL。

对照组：半红期壶瓶枣挑选清洗后放置在小型玻璃发酵罐中在温度为65 ℃、湿度为40%的恒温恒湿培养箱中黑化15 d后，放置在80 ℃烘箱烘干至含水量为20%。记为CK。

三蒸三制处理组：蒸锅中的水沸腾产生热蒸汽后，将挑选清洗后的半红期壶瓶枣常压蒸制30 min，放凉转入到温度为65 ℃的电热恒温干燥箱中（无鼓风）1 h，反复3次，其他加工处理方法同对照组。记为Z+CK。

外源美拉德反应液处理组：半红期壶瓶枣挑选清洗后在美拉德反应液中浸泡4 h后取出，其他加工处理方法同对照组。记为MF。

三蒸三制+外源美拉德反应液处理组：将经过三蒸三制处理后的半红期壶瓶枣置于美拉德反应液中浸泡4 h后取出，其他加工处理方法同对照组。记为Z+MF。

外源多酚氧化酶处理：将半红期壶瓶枣置于多酚氧化酶液中浸泡4 h后取出，其他加工处理方法同对照组。记为MC组。

三蒸三制+外源多酚氧化酶液处理组：将经过三蒸三制处理后的半红期壶瓶枣置于多酚氧化酶液中浸泡4 h后取出，其他加工处理方法同对照组。记为Z+MC。

1.3.2 GC-IMS分析条件

HS进样条件：孵化温度40 ℃；孵化时间15 min；进样针温度85 ℃；进样体积300 μL。

GC条件：MXT-5色谱柱（15 mh?.53 mm，1 μm）；柱温60 ℃；初始流速2 mL/min，升至10 min时流速为10 mL/min，10～20 min，流速从10 mL/min升至120 mL/min。

IMS条件：漂移管长度5 cm；管内线性电压400 V/cm；漂移气流量150 mL/min；载气/漂移气N2；载气流量0～2 min，2 mL/min；IMS温度45 ℃。

样品前处理：将6种不同处理方式得到黑枣产品放进组织绞碎机打碎，取粉碎样品2 g装入20 mL HS瓶中。将处理好的样品在40 ℃孵育15 min后进样300 μL。

1.3.3 GC-MS分析条件

参考宋建新方法[17]，并稍作修改。

HS萃取条件：称取黑枣粉碎样品2 g，置于20 mL螺口固相微萃取样品瓶中，HS小瓶用聚四氟乙烯硅塞紧瓶盖，旋紧瓶盖后将样品置于40 ℃条件下平衡15 min后，将聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（65 μm，PDMS/DVB）萃取头插入HS小瓶中萃取30 min，最后将萃取头拔出并置于250 ℃进样口中解吸3 min。

GC条件：DB-WAX色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；柱温箱初始温度40 ℃，进样口温度250 ℃，不分流进样，载气（He）载气流速1 mL/min；柱温箱升温程序：40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。

MS条件：离子源温度200 ℃；传输线温度250 ℃；采用全扫描模式采集信号；质量扫描范围m/z35～500。

1.4 数据处理

GC-IMS组分特征峰对应的保留时间和迁移时间可用于物质定性，检测结果通过内置的NIST2014GC保留指数数据库与G.A.S的IMS迁移时间数据库二维定性。GC-MS检测结果通过计算机标准物质质谱数据库（NIST11）检索处理，根据保留指数，统计匹配度大于80%的挥发性成分，并参考相关文献定性鉴定检出成分，确定挥发性物质的化学组成，按面积归一法计算各成分的相对含量。数据分析采用仪器配套的分析软件为LAV（Laboratory Analytical Viewer）和GChIMS Library Search（内置NIST2014、IMS数据库）。利用Simca PCA插件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）；聚类分析热图利用Helm作图；利用Origin2019b对分析结果进行绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式黑枣挥发性物质的GC-IMS分析

如图1所示，横坐标1.0处红色竖线为反应离子峰（经归一化处理），根据峰（色点）的有无或者颜色深浅能够直观表现不同样品之间的组分及浓度差异。枣果经过三蒸三制处理后的红点较多，说明黑枣中的挥发性组分经过高温蒸制以及高温干燥皱缩导致枣果细胞破裂，更多组分相互作用变得更加丰富，且组分含量越来越多。

图1 不同处理方式下黑枣样品中挥发性化合物特征峰位置点Fig.1 Characteristic peak location points in GC-IMS spectra of volatile organic compounds in black jujube samples

为了更加清晰地比较样品间差异，采用差异对比模式，将不同处理方式的黑枣样品绘制成二维差异图谱，如图2所示。差异图谱以CK组样品的谱图作为参照，对比显示剩余5个黑枣样品的谱图，红色代表该物质在该样品中浓度高于参照样品，而蓝色则代表低于参照样品。三蒸三制后挥发性成分的含量明显增多。同时可以观察到Z+MC处理组没有产生新的物质，多酚氧化酶在褐变过程中失活对黑枣挥发性风味物质的影响不显著。

图2 不同处理方式下黑枣的GC-IMS及其差异图Fig.2 Raw and differential GC-IMS spectra of black jujube samples

通过挥发性物质的指纹谱图（图3），可以直观且定量地比较不同样品之间的挥发性有机物差异，颜色深浅代表浓度高低，通过纵向比较，不同挥发性成分呈现一定的规律。

图3 不同处理方式下黑枣挥发性成分GC-IMS差异图谱Fig.3 Differential GC-IMS spectra of volatile organic compounds in black jujube samples

2.2 不同处理方式黑枣挥发性成分的GC-IMS和GC-MS分析

采用GC-IMS和GC-MS分析6种黑枣的挥发性成分，见表1、2，图4～6。

表1 GC-IMS分析黑枣挥发性成分分析Table 1 Analysis of volatile components in black jujube by GC-IMS

续表1

表2 GC-MS分析黑枣挥发性成分分析Table 2 Analysis of volatile components in black jujube by GC-MS

续表2

续表2

由图5结合表1可知，不同处理方式黑枣采用GC-IMS检测出47种挥发性成分，这些有机物分子C链大多在C2～C18之间，包括醛类17种、醇类10种、酯类10种、酮类4种、呋喃类3种、酸类2种、其他1种，醛类化合物是黑枣主要的挥发性成分，相对含量为44%～47%。由图6可知，不同处理方式黑枣采用GC-MS共检测出128种挥发性成分，包括醛类21种、醇类23种、酯类20种、酮类16种、呋喃类3种、酸类20种、酚类4种、萜烯类12种、烷烃类9种。GC-MS和GC-IMS两种检测方法检出的基础风味物质种类基本一致。对比分析三蒸三制处理组（Z+CK、Z+MF、Z+MC）与未经过三蒸三制样品黑枣共有风味物质，由图4可知，共有风味物质为6～10种，多为壬醛、庚醛、糠醛、正己醛、苯甲醛、1-甲基环庚醇、2-乙酰基呋喃、冰醋酸。糠醛、庚醛、壬醛、正辛醛、冰醋酸为6种黑枣共有风味物质。

图4 GC-MS和GC-IMS测定黑枣中风味物质Venn图Fig.4 Venn diagram of flavor substances in black jujube determined by GC-MS and GC-IMS

图5 GC-IMS测定黑枣中挥发性成分雷达图Fig.5 GC-IMS radar chart of volatile organic compounds in black jujube

图6 GC-MS测定不同处理方式黑枣挥发性风味物质相对含量变化Fig.6 Comparative relative contents of volatile flavor substances in different black jujube samples determined by GC-MS

2.3 黑枣中挥发性组分聚类分析

利用雷达图对不同处理方式下黑枣的挥发性成分进行分类是不够的。因此，采用PCA和聚类分析对不同处理方式下的黑枣挥发性成分进行分类[22]，样本相似的聚集在一起。通过对PCA得分和载荷值找到相关的物质，各样品的挥发性有机物数据是在相似信息的基础上进行收集和分类，结果见图7。

对表1中47种的化学物质按各自类别进行编号后（f1～f47），采用Simac PCA软件进行PCA，提取2个PC，根据其贡献值大小将其命名为PC1和PC2，累计贡献率为74.3%。如图7A所示，6个处理组被分成3个集群，不同处理的黑枣挥发性成分分离较好，具有明显的区域分布。MF和Z+MF处理组处于第1象限，CK和MC处理组处于第3象限，Z+CK和Z+MC处理组处于第4象限。如图7B所示，在47种挥发性成分中，糠醛（单体）、异丙醇、乙酸丁酯（二聚体）、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2-丁酮、冰醋酸对黑枣风味有较大贡献。其中，CK组的苯乙醛、苯甲醛（单体）、苯甲醛（二聚体）、1-戊醇（二聚体）、乙酸丁酯（二聚体）、乙酸乙酯（二聚体）、3-羟基-2-丁酮的含量显著高于其他处理组；糠醛（单体）和3-甲基丁醛（单体）在Z+CK、Z+MF、Z+MC处理显著增加；Z+CK处理乙酸甲酯、丙酮、冰醋酸的含量较多。Z+MC处理对黑枣风味特征物质的贡献较小。

图7 挥发性风味物质PCA得分图（A）和散点图（B）Fig.7 PCA score (A) and scatter plots (B) of volatile flavor compounds

2.4 黑枣中挥发性化合物热图分析

图8 47种黑枣挥发性成分的热图Fig.8 Heat map of 47 volatile compounds in black jujube

根据图8可以看出，CK与MF样本中酯类水平最高，如乙酸乙酯、己酸甲酯、丁酸甲酯含量在CK中最高，而乙酸异戊酯、乙酸丁酯、丙酸丁酯在MF中含量最高。反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、乙酸、丙酸等在Z+CK中含量最高；2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2-呋喃甲醇等在MC中含量最高；2-乙酰呋喃在Z+MF中含量最高；各挥发性组分在Z+CK中的含量均高于其他样本。

醛类是黑枣中的重要的香气成分，由于不饱和脂肪酸的自动氧化作用产生了醛类的挥发性成分[23]。主要包括己醛（青草香）、反-2-己烯醛（青草香）、反-2-庚烯醛（苹果、蔬菜味香）、苯甲醛（苦杏仁香）和反-2-壬烯醛（清香油脂香）、糠醛（面包、杏仁味）等醛类挥发性成分化合物。己醛和反式-2-己烯醛是由枣果中的亚油酸和亚麻酸在成熟过程中氧化产生[24]，是枣中特征香气的重要组成成分，主要呈现出青香的风味。枣果在加热过程中发生的美拉德反应，是黑枣香气形成的主要因素。3-甲基丁醛、3-甲基硫基丙醛是支链醛等主要来源于Strecker降解反应[25]。枣果中的糖类与含氮类的氨基酸在加热过程中以及抗坏血酸在热降解中生成糠醛，经过三蒸三制后2种检测方法糠醛的相对含量分别为34.055%与15.87%，与Sun Xin等[11]的研究结果一致。酮类化合物大部分是脂肪氧化产物和美拉德反应产物，一般对风味具有修饰作用。其中2种检测方法中都检测出的3-羟基-2-丁酮可能是美拉德反应第2阶段中羟基和羰基碎裂作用的产物[26]，对黑枣风味的形成和增强有一定的贡献。冯涛等[27]通过单纯的糖与氨基酸反应得到的酮类化合物与本研究结果一致，由此可推测，酮类化合物的产生于与美拉德反应直接相关。醇类化合物是主要来源于氨基酸的转化、发酵及亚麻酸降解物氧化，由醛进一步分解形成，大部分都具有令人愉快和圆润的香气特征，不同处理之间的差异不大[28]。酸类化合物一般阈值较高，不同处理方式加工的黑枣中酸类化合物的种类较少。但是，鲜枣中含有丰富的有机酸[29-30]，如苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、奎宁酸、草酸、富马酸、桦木酸、齐墩果酸和熊果酸等，可以为酯化反应提供原料。黑枣中酯类化合物多数可能来自酯化反应和各种产物之间的相互反应[31]，如不饱和醛的氧化，在酶的作用下，枣果中的葡萄糖也可以通过生物合成形成酯类，此外糖还可以实现甜味和香味之间的感官相互联动[32]。低级饱和单羧酸或多数的不饱和单有机酸与低级脂肪醇所形成的酯类都具有各种愉快的水果香气。不同处理方式下酯类化合物的种类较少，相对含量较低；经过三蒸三制处理后酯类化合物的相对含量减少，2种检测方法结果一致。酚类物质被描述为烟熏香、焦香味，一般阈值不大，对风味物质贡献较大。呋喃化合物主要是美拉德反应和硫胺素热降解的产物。萜烯类化合物具有柠檬香气、柑橘香、药草香、木香、青香、花香、甜香等香气[33]，例如，β-蒎烯、萜品烯、罗勒烯、萜品油烯赋予了黑枣样品清新草木香、花香、果香。枣中还有大量的烷烃类化合物，如十四烷、十六烷等，但烷烃类化合物一般是无味的，对枣香气贡献不大。

3 结 论

分别采用GC-MS和GC-IMS两种检测方法检出的基础风味物质种类基本一致。对比分析三蒸三制处理组（Z+CK、Z+MF、Z+MC）与未经过三蒸三制样品黑枣共有风味物质。不同处理方式得到的主要挥发性成分各不相同，且不同处理黑枣的挥发性组分变化总趋势基本一致，糠醛（单体）、异丙醇、乙酸丁酯（二聚体）、乙酸甲酯、丁酸甲酯、2-丁酮、冰醋酸对黑枣风味有较大的贡献。其中，CK组的苯乙醛、苯甲醛（单体）、苯甲醛（二聚体）、1-戊醇（二聚体）、乙酸丁酯（二聚体）、乙酸乙酯（二聚体）、3-羟基-2-丁酮相对含量显著高于其他处理组；糠醛（单体）和3-甲基丁醛（单体）在Z+CK、Z+MF、Z+MC处理显著增加；Z+CK处理中乙酸甲酯、丙酮、冰醋酸相对含量较多。糠醛、乙酯和丙酮作为美拉德反应中的主要的芳香活性成分，表明黑枣经过三蒸三制处理后挥发性成分的增加，高温高湿加热过程中发生的化学反应对黑枣特有香气的形成具有重要作用。多酚氧化酶在褐变的同时对黑枣挥发性风味物质的影响不显著（P＞0.05）。Z+CK可以提高黑枣的品质和增加黑枣的风味，为改进黑枣加工工艺及褐变机制提供理论依据。同时说明，GC-IMS技术可以应用于快速鉴定和差异分析不同黑枣样品挥发性成分。