贺兰山东麓‘美乐’自然发酵干红葡萄酒品质特性

李 伟，张 众，王 礼，孙丽君，郑永丽，夏鸿川，张军翔,4,*

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川 750021；3.宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750021；4.中国葡萄酒产业技术研究院，宁夏 银川 750021）

自然发酵葡萄酒（自然葡萄酒），普遍被认为是葡萄原料采用有机方式栽培，生产过程中尽量不添加商业酵母、SO2等辅料并减少人为干预而生产的一种具有产区风土特色的葡萄酒[1]。随着无添加、无污染、绿色食品观念深入人心，消费者对葡萄酒风格创新的需求、葡萄酒生产可持续发展理念为葡萄酒产业带来新的机遇与挑战，自然葡萄酒应运而生[1-3]。自然葡萄酒的品质并不一定突出，往往凭借其无添加、独具风格特色更容易被消费者所接受，并愿意为其支付更高的价格[4-5]。

商业酵母、SO2、酒石酸等发酵辅料在葡萄酒生产中广泛使用，用来提高葡萄酒品质、迅速启动发酵和规避风险[6-7]；品质稳定的传统工艺葡萄酒却往往容易失去所应具有的产区独特风格。香气是评价葡萄酒品质最重要的指标之一，通常按照来源将其分为品种香气、发酵香气和陈酿香气；发酵香气主要包括酵母菌氨基酸分解代谢Ehrlich途径所产生的醇类物质、醇类酶促作用形成的酯类物质，其成分和含量由微生物种群和发酵条件所决定；发酵香气一般呈现果香特征、感官阈值较高，通常多种香气成分结合共同构成葡萄酒基本香气特征[8-10]。在法国、意大利等多个国家用本土酵母生产的葡萄酒品质较为突出，具有独特而典型的当地风格特色，普遍认为自然葡萄酒香气更复杂[6-7,11-13]；Amparo等[14]认为非酿酒酵母Ehrlich途径产生更多的高级醇、乙酯和乙酸酯；Uzkuç等[12]在自然发酵葡萄酒中检测到更多的酯类物质，果香更浓郁，酒体和整体评价均高于接种葡萄酒。但是，自然发酵过程的顺利进行以及自然葡萄酒品质问题也尤为关键，有研究发现潜在乙醇体积分数过高的原料自然发酵不能彻底完成[7,11]，发酵辅料缺失会导致对果皮中酚类物质和香气成分的浸渍效果较差，生产的自然葡萄酒颜色浅、香气淡[15-16]；抑菌剂的缺失会导致有害微生物的滋生，生成马厩味、皮革味等负面香气[10,17]，甚至生成有毒物质，这都是必须要正视的问题。至今为止，世界范围内有大量倡导自然葡萄酒的生产者，科学研究大多聚焦在自然发酵微生物的研究[18-19]，对自然葡萄酒品质的研究报道较少，自然葡萄酒的品质和特点与产地密切相关，贺兰山东麓自然葡萄酒品质特征有待明确。

贺兰山东麓葡萄酒产区自然条件得天独厚，葡萄酒品质优良；‘美乐’作为世界栽种面积第二大的酿酒葡萄品种，在贺兰山东麓广泛种植。本研究以宁夏贺兰山东麓产区‘美乐’葡萄为试材，对比研究自然葡萄酒和传统工艺葡萄酒基本理化指标、酚类参数、香气成分和感官品质的差异，探究贺兰山东麓自然葡萄酒的品质特性，研究对于充分揭示贺兰山东麓‘美乐’自然干红葡萄酒的风格与特性有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄原料‘美乐’于2020年9月18日分别采自贺兰山东麓银川（YC）、永宁（YN）、青铜峡（QTX）3个子产区，葡萄树龄为6～7 a，总糖质量浓度（以还原糖计）分别为249.12、251.96、251.23 g/L，可滴定酸质量浓度（以酒石酸计）分别为5.15、5.87、6.24 g/L，pH值分别为3.92、3.86、3.74。

酿酒辅料：Excellence SP活性干酵母、Vinozym vintage FCE果胶酶、偏重亚硫酸钾、Oenostim酵母营养剂等 法国Lamothe-Abiet公司。

碳酸钠、没食子酸、亚硫酸氢钠、浓盐酸、福林-肖卡、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；C8～C20正构烷烃（≥99.7%，GC）美国Sigma-Aldrich公司；4-甲基-2-戊醇（≥98.0%，GC）日本TCI公司。

1.2 仪器与设备

7890B气相色谱-7000D质谱联用仪 美国Agilent公司；PAL3自动进样器 瑞士CTC公司；TU-1901紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；雷磁PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；ME104E电子天平 瑞士Mettle公司；Enology Y15葡萄酒全自动分析仪 西班牙Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒酿造工艺

葡萄采收后经除梗、破碎、混匀后转入彻底灭菌的10 L玻璃发酵罐，分为自然葡萄酒（以下简称为NW）和传统工艺葡萄酒（以下简称为CK）两组，每组3次重复。其中NW不做任何添加，CK添加商业酵母200 mg/L、偏重亚硫酸钾60 mg/L、果胶酶30 mg/L、酵母营养剂150 mg/L；其他工艺条件均相同。使用带有单向排气阀的橡胶塞密闭发酵，乙醇发酵温度控制在25～27 ℃，每天进行3次手工压帽，通过观察酒帽情况、产气情况调整监测相对密度频率，相对密度降至0.995以下时分离皮渣，静置澄清后进行理化分析和感官评价。

1.3.2 葡萄酒品质指标测定

乙醇体积分数、残糖、总酸、挥发酸、干浸出物等常规理化指标：参照GB/T 15038ü2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》方法测定；pH值：pH计直接测定；甘油、苹果酸、乳酸含量：用葡萄酒全自动分析仪测定；总酚含量：用福林-肖卡法[20]测定（以没食子酸计）；单宁含量：参考Bate-Smith等[21]的方法测定；花色苷含量：用亚硫酸盐脱色法测定[22]；颜色指标用CIEL*a*b*颜色空间参数表示[23]。

1.3.3 挥发性成分测定

使用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（head spacesolid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技术对葡萄酒香气成分进行检测，检测方法参考Hjelmeland等[24]的研究略作改动。

前处理：将1.5 g氯化钠、5 mL葡萄酒样品、10 μL 4-甲基-2-戊醇内标（1.008 3 g/L）依次加入20 mL的顶空瓶中；振摇器转速250 r/min，40 ℃保温5 min，40 ℃萃取30 min，进样口240 ℃解吸10 min。

色谱条件：Agilent J&W DB-WAX色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始柱温40 ℃，恒温5 min，然后依次以3 ℃/min升到97 ℃，以2 ℃/min升到120 ℃，以3 ℃/min升到150 ℃，以8 ℃/min升到220 ℃，保持10 min；载气高纯氦气（纯度≥99.999%），流速1 mL/min，不分流进样。

质谱条件：传输线温度230 ℃，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV；质量扫描范围m/z40～300。

挥发性物质定性定量：提取挥发性成分质谱图，通过NIST 2017质谱库进行检索，并根据C8～C20烷烃混合标准品的保留时间，用保留指数（retention index，RI）法对挥发性物质进行定性。香气成分浓度以香气成分峰面积与内标峰面积的比值，再乘内标浓度进行定量。

1.3.4 葡萄酒感官评价

葡萄酒感官品评小组由宁夏大学葡萄酒专业老师和学生组成，共22 名（10 名男性，12 名女性，年龄在22～48 岁之间），每名品尝员均接受过至少3 a的葡萄酒感官分析训练。评分标准参考国际葡萄与葡萄酒组织制定的百分制感官评价体系对葡萄酒品质进行打分，并从Davis香气轮盘中选取合适的词汇进行香气特征描述[25]。

1.4 数据统计分析

使用SPSS 26软件进行基本的数据处理和单因素方差分析，LSD法进行事后比较；用Origin 2018软件绘制柱状图；基于R4.0.3用Pheatmap程序包绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 ‘美乐’自然葡萄酒基本理化指标分析

乙醇体积分数和残糖作为葡萄酒最基本的理化指标，给葡萄酒带来圆润、柔顺等感觉，并用来评价乙醇发酵是否彻底[8]。贺兰山东麓葡萄原料潜在乙醇体积分数高，自然发酵使用野生酵母发酵，不添加酵母营养成分，乙醇发酵能否彻底完成存在隐患。在Blanco等[7]的研究中，潜在乙醇体积分数为14.6%的西班牙白色酿酒葡萄乙醇转化率较低、残糖含量较高；Patrignani等[11]的研究也表明，乙醇体积分数14.8%的桑娇维赛葡萄酒含有较多残糖。由表1可见，贺兰山东麓3个子产区CK和NW的乙醇体积分数无显著差异（P＞0.05）；虽然CK和NW残糖含量有显著差异（P＜0.05），但是都低于4 g/L，表明贺兰山东麓‘美乐’葡萄在潜在乙醇体积分数14.5%的情况下自然发酵可以彻底完成，这一结论与Liu Peitong[13]和Uzkuç[12]等在其他产区的研究结果一致。干浸出物是评价葡萄酒品质的重要指标，也是鉴定葡萄酒真伪的重要依据，质量浓度应在17 g/L以上；所有酒样的干浸出物质量浓度在34.68～37.21 g/L之间，CK和NW无显著差异。

表1 葡萄酒样品基本理化指标Table 1 Basic oenological parameters of wine samples

葡萄酒中有机酸主要包括酒石酸、苹果酸、乳酸、醋酸等，对干红葡萄酒的颜色、口感、陈酿潜力等产生影响[8]。由表1可知，NW和CK的可滴定酸含量和pH值在3个子产区没有表现出规律性差异；NW的苹果酸含量显著低于CK，乳酸质量浓度都在0.30 g/L以上，表明自然发酵期间苹果酸-乳酸发酵已经启动，将一部分苹果酸转化为乳酸，Sannino等[6]的研究同样证实了这一观点。3个产区酒样NW挥发酸含量都极显著差异（P＜0.01）高于CK，非酿酒酵母[13,26]、乳酸菌[27-28]、醋酸菌[29]等微生物的活动都有可能是导致挥发酸含量升高的原因。

甘油是乙醇发酵最主要的副产物之一，会给葡萄酒带了圆润的口感，质量浓度一般在3～14 g/L之间[8]。所有酒样甘油质量浓度在5.97～9.49 g/L之间（表1），但NW的甘油含量均显著低于CK，自然发酵产生甘油较少，目前并没有研究得出类似的结论；但是大量研究倾向于筛选高产甘油的酵母菌株[30-31]可能会促使商业酵母产甘油能力更强，甘油含量高低对于贺兰山东麓自然葡萄酒品质的影响有待进一步探究。

综上所述，在一定潜在乙醇体积分数的范围内，本产区‘美乐’自然葡萄酒符合GB/T 15037ü2006《葡萄酒》对葡萄酒的基本规定，但应保证葡萄原料、生产环境卫生条件以避免可能出现的污染风险。

2.2 ‘美乐’自然葡萄酒酚类物质及颜色参数分析

葡萄酒中的酚类物质主要包括色素和无色多酚，对干红葡萄酒的颜色、口感具有非常重要的影响[8]。由表2可见，3个子产区自然葡萄酒总酚质量浓度在2.56～3.48 g/L之间，NW比CK低7.32%；单宁质量浓度在1.66～2.60 g/L之间，NW比CK低16.93%；花色苷质量浓度在582.63～827.39 mg/L之间，NW比CK低13.64%；自然葡萄酒的酚类物质含量均低于传统工艺葡萄酒。

颜色作为葡萄酒最重要的外观指标，对葡萄酒感官品质具有重要意义。颜色主要受酚类物质的含量和种类的影响[25]。CIEL*a*b*是由国际照明协会（Commission Internationale de l´Eclairage，CIE）提出的一种颜色系统表示方法，广泛应用于葡萄酒颜色表征；分别用L*、a*、b*表示葡萄酒的光泽度、红色色调和黄色色调，用C*ab表示色彩饱和度（色度）、H*ab表示色调角（色调）。如表2所示，3个子产区NW亮度参数（L*）显著高于CK，色彩饱和度（C*ab）和红色色调（a*）显著低于CK，而黄色色调（b*）、色调角（H*ab）在3个子产区没有表现出一致规律；表明自然葡萄酒的亮度略高于传统葡萄酒，但颜色比传统工艺葡萄酒浅、红色色调较弱，整体色调无显著差异。

表2 葡萄酒样品酚类物质含量及CIE L*a*b*颜色参数Table 2 Phenol contents and color parameters of wine samples

酚类物质存在于葡萄果皮和种子，通过浸渍作用进入葡萄酒。有研究表明，发酵前期SO2的使用会增强对花青素的浸渍效果，而成品酒中含量差别并不大[32]；Patrignani等[11]在使用SO2的葡萄醪中进行自然发酵并没有影响葡萄酒的颜色，表明SO2对自然葡萄酒酚类物质和颜色影响微乎其微。大量研究认为酶制剂的使用能够有效增强对单宁类物质的浸渍效果，对花青素的效果较弱[15,33]；目前尚未见到酵母菌种直接影响酚类物质含量的报道，但有研究认为酵母菌可能会通过影响乙醇体积分数进而改变对酚类物质的浸渍效果[33]；综上，自然葡萄酒的酚类物质含量较低、颜色较浅，可能是由酶制剂和SO2差异所导致，而非微生物。

2.3 ‘美乐’自然葡萄酒香气成分分析

葡萄酒香气是影响葡萄酒品质的最重要因素之一，是由葡萄酒中挥发性物质的组成、含量和挥发能力所决定。在所有的葡萄酒样品中共检测到55种香气物质（表3），包括酯类物质31种、醇类物质12种、酸类物质4种、萜烯类物质2种、酚类物质3种、其他类物质3种。所有酒样的挥发性物质总质量浓度在180.36～259.93 mg/L之间（图1A），3个子产区都表现出CK高于NW的规律。

酯类物质是葡萄酒香气最主要的贡献物质，能够给葡萄酒带来果香味的香气特征，在发酵期间酯类物质主要由醇类物质和酰基辅酶A通过酶促反应生成[10]。如图1B所示，所有酒样的酯类物质质量浓度在72.17～129.77 mg/L之间，3个子产区CK酯类物质含量和所占比例都显著高于NW。根据分子质量和结构，将酯类物质分为C6以下短链脂肪酸酯、C6～C10中链脂肪酸酯、C10以上脂肪酸酯、芳香族酯类、其他酯类5个类别（表3）。含量最高的酯类物质是辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯3种中链脂肪酸乙酯，具有菠萝、苹果、草莓等水果香气，基本表现出NW低于CK的一致规律；所有酒样短链脂肪酸酯含量较低，2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、丁酸戊酯只在CK中发现，其他短链脂肪酸酯含量没有一致规律；长链脂肪酸酯在3个产区中表现出NW高于CK的一致规律，十一酸乙酯和油酸乙酯只在NW中发现，表明自然发酵会产生更多的长链脂肪酸酯类物质。其他酯类物质包括3-羟基丁酸乙酯（果香、青草）和乳酸异戊酯（焦糖）两种，在NW中的含量高于CK，其中乳酸异戊酯只在NW中检测到，同样证明乙醇发酵期间已经启动苹果酸-乳酸发酵。

表3 葡萄酒样品香气物质含量及感官特征Table 3 Concentrations of aroma components and sensory characteristics of wine samples μg/L

续表3 μg/L

图1 葡萄酒样品香气成分含量及比例Fig.1 Contents and proportions of aroma components in wine samples

醇类物质是酵母菌在乙醇发酵期间的主要代谢产物之一，对葡萄酒香气品质的影响较大。高级脂肪醇质量浓度低于300 mg/L时能够增加葡萄酒香气的复杂度，若超过此质量浓度，则会给葡萄酒带来乙醇味、辛辣味、脂肪味等不好的气味特征[10]。如图1C所示，所有酒样的醇类物质质量浓度在101.29～119.52 mg/L之间，3个产区CK醇类物质含量都高于NW，但是NW醇类物质所占比例更高。在Varela[34]、Liu Peitong[13]等的研究中，同样发现自然发酵葡萄酒中表现出较高水平的醇类物质；但Uzkuç等[12]的研究中两个品种表现出不一样的规律，其认为是由品种差异造成。脂肪酸具有奶酪、脂肪等香气特征，CK酸类物质含量和比例显著高于NW（图1D），4种酸类物质全部表现出CK高于NW的一致规律。NW酚类物质含量和比例显著高于CK（图1E），2,4-二叔丁基苯酚（石碳酸味）在所有酒样中都存在，而4-乙基愈创木

酚（香料、木香）、4-乙基苯酚（化学、鞋油）只存在于NW中，增强自然葡萄酒的香气复杂性，前人研究认为愈创木酚类物质来源于橡木桶陈酿[35]。来源于葡萄果实的萜烯类物质香茅醇、里那醇在CK中含量高于NW（图1F），发酵过程中浸渍效果以及酵母菌分泌胞外糖苷酶能力的差异可能是导致这一现象的原因。其他类物质3-甲巯基丙醇（马铃薯）、苯乙烯（汽油、矿物质）在所有酒样中都有发现，3-甲巯基丙醇来源于葡萄果实，NW含量低于CK，而NW苯乙烯含量较高。

利用R软件对香气成分进行聚类热图分析，将香气成分聚为3 大类（图2列聚类）。第1类包括只在自然葡萄酒中见到的乳酸异戊酯、3-羟基丁酸乙酯等，只在传统葡萄酒中检测到的辛酸异戊酯、2-甲基丁酸乙酯、月桂酸等，还包括在所有酒样中含量没有明显规律的乙酸异戊酯、乙酸己酯、异丁醇等；第2类在传统葡萄酒中含量较高，包括所有的C6～C10脂肪酸乙酯、苯甲醇、短链脂肪酸酯等发酵香气，来源于葡萄果实的香茅醇、3-甲巯基丙醇等；第3类香气在自然葡萄酒中含量较高，包括长链脂肪酸乙酯、4-乙基愈创木酚、苯乙烯、水杨酸酯等香气物质，使自然葡萄酒香气更复杂。聚类分析将6种酒样聚为2类（图2行聚类），能够对自然葡萄酒和传统工艺葡萄酒进行区分，即贺兰山东麓‘美乐’自然葡萄酒有典型的香气特征。

图2 葡萄酒样品香气成分聚类热图分析Fig.2 Heat map obtained from cluster analysis of aroma components in wine samples

综上所述，自然葡萄酒香气成分总量低于传统葡萄酒，可能由微生物数量和葡萄果皮的浸渍效果导致；自然葡萄酒醇类物质比例更高，生成较多的C10以上长链脂肪酸酯和酚类物质，增强自然葡萄酒的香气复杂度和辨识度。

2.4 ‘美乐’自然葡萄酒感官品质分析

葡萄酒感官品鉴是从外观、香气、口感等方面对葡萄酒品质做综合评价。感官品鉴小组对葡萄酒样品的评价见表4，所有酒样的感官品鉴总分在84.09～86.05之间，属于优质健康的干红葡萄酒。从外观品质看，所有酒样澄清透亮；色度表示颜色深浅，表现出CK略高于NW的一致规律，与颜色指标一致；酒样呈紫色色调，NW和CK没有明显差异。从香气品质看，NW香气纯正度、协调度得分高于CK，可能是由于CK生成了较多具有负面香气特征的癸酸、辛酸等脂肪酸类物质；CK和NW香气浓郁度和优雅度并没有表现出明显区别，由此可见自然葡萄酒的综合香气评价并不比传统工艺葡萄酒低。CK和NW的所有口感指标都没有一致规律，口感特征并没有被区分，即便传统工艺葡萄酒的酚类物质和甘油等略高于自然葡萄酒。3个产区NW的总体评价和总分都略高于CK，虽然无显著差异，但是可以表明自然葡萄酒的品质被认可，并不比传统工艺葡萄酒表现差。

表4 葡萄酒样品感官品质得分及香气特征Table 4 Sensory scores and aroma characteristics of wine samples

表中展示了品鉴小组提供的出现频率最高的香气特征描述词，传统工艺葡萄酒具有‘美乐’新酒的典型香气特征，主要表现出黑莓、樱桃、黑醋栗、草莓等明显果香，而自然葡萄酒的果香特征描述弱于传统工艺葡萄酒，但有草药、薄荷、香草等更复杂的香气特征，表明自然葡萄酒香气特征更加复杂，与前人的研究结果相似[12-14,34]。但是也有品评员认为自然葡萄酒有轻微氧化的负面香气。

3 结 论

贺兰山东麓‘美乐’自然葡萄酒在潜在乙醇体积分数14.5%的情况下，乙醇发酵可以彻底完成，乙醇体积分数、残糖、干浸出物、pH值等常规理化指标与传统工艺葡萄酒无差异，多种菌种的混合导致自然葡萄酒的挥发酸含量较高。自然葡萄酒中乳酸含量较高，在乙醇发酵过程中已经启动苹果酸-乳酸发酵；自然葡萄酒生成的甘油、总酚、单宁、花色苷含量较低，但是感官分析颜色和口感上与传统工艺葡萄酒并没有表现出明显差异。

自然葡萄酒的香气成分总量低于传统工艺葡萄酒，可能由微生物菌群浓度差异、未使用辅料、果皮的浸渍效果较弱等原因导致；自然葡萄酒中具有果香特征的短链、中链脂肪酸酯类物质较少，醇类物质比例高，C10以上长链脂肪酸乙酯、酚类物质含量高。聚类分析将3个自然葡萄酒聚为一类，表明自然葡萄酒的香气特征有辨识度，具有区别于传统工艺葡萄酒的产区风土特色。自然葡萄酒有杏仁、胡椒、香草等更复杂的香气特征，整体评价略高于传统工艺葡萄酒。综上，贺兰山东麓‘美乐’自然干红葡萄酒的品质较为突出，具有区别于传统工艺葡萄酒的风格特色。