油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的检测方法及加工条件对其生成的影响

董 浩，徐 燕，吴家大，冼燕萍，杨 娟，于立梅，钱 敏，曾晓房,*，白卫东,*

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 州 510225；2.仲恺农业工程学院 广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，现代农业工程创新研究院，广东 广州 510225；3.广州质量监督检测研究院，食品安全预警研发中心，广东 广州 510447）

杂环胺是富含蛋白质的食品在热加工过程中由蛋白质、氨基酸、糖类以及其他物质发生美拉德反应或裂解反应而生成的一类致癌、致突变化合物[1-2]。迄今已经从食品中分离和鉴定出约30种杂环胺，主要常见于油炸、油煎、烧烤类肉制品中[3-4]。按照化学结构和生成途径的不同，杂环胺可分为两大类，分别为氨基咪唑氮杂芳烃类和氨基咔啉类，其中氨基咪唑氮杂芳烃类杂环胺在200 ℃以下加热条件下就能形成，而氨基咔啉类杂环胺一般在200 ℃以上由氨基酸或蛋白质受热降解生成[5]。人体若摄入过多含有杂环胺的食物，将可能导致体内肝脏、胃肠道、膀胱、皮肤以及口腔等多种器官产生病变[6]。因此，肉制品热加工过程中杂环胺的控制受到众多相关研究人员的关注[7-9]。

肉制品中杂环胺的生成受到多种因素影响，如肉种类、烹调方式、加热温度和时间、前体物和脂质种类以及水分含量等，通过选择合适的烹调方式和加工条件能够一定程度减少杂环胺的生成[10]。大量研究表明，水煮等低温烹饪方式相对于油炸等高温烹饪方式会产生更少的杂环胺[11-16]。但由于油炸或者油煎过程能够提升肉的风味，增进食欲，因此油煎等烹饪方式深受消费者喜爱。加热温度和时间是影响杂环胺种类和含量的主要因素，降低加工温度、减少加工时间可有效降低杂环胺在肉制品中的生成[17]。虽然烹饪方式、加热温度、加热时间等因素对肉制品中杂环胺的影响研究已有较多报道[18-22]，但研究多集中在加工条件对氨基咪唑氮杂芳烃类杂环胺生成的影响，且加工锅具、食用油等热加工条件对肉制品中杂环胺种类和含量的研究还相对较少[23-24]。

因此，本实验以2-氨基-3-甲基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole，MeAαC）、2-氨基-9H-吡啶并[2,3-b]吲哚（2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole，AαC）、1-甲基-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（1-methyl-9H-pyrido[3,4-b]indole，Harman）、9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（9H-pyrido[3,4-b]indole，Norharman）、3-氨基-1,4-二甲基-5H-吡啶并[4,3-b]-吲哚（3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]-indole，Trp-P-1）和3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚（3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-2）6种氨基咔啉类杂环胺为研究对象，建立一种同时测定猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测方法。重点研究加工条件（如油煎时间、油种类、锅具、肉饼尺寸等）对6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响，以期为烹饪条件的合理选择和肉制品热加工过程中杂环胺的减控提供数据支撑和方法指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

排酸后冷鲜猪肉，购自广州市海珠区家乐福超市。

MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2标准品（纯度均大于0.995） 上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯） 美国Merck公司；甲酸、乙酸铵（均为色谱纯） 美国CNW公司；氨水（分析纯） 国药化学试剂有限公司；氢氧化钠、氯化钠（均为分析纯） 广州化学试剂厂；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

StrataTM-X-C固相萃取柱（60 mg/3 mL） 美国Phenomenex公司；Ulimate 3000超高效液相色谱仪、Q Exactive Focus四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱 美国Thermo Fisher Scientific公司；MS3digital涡旋混合器美国IKA公司；Milli-Q超纯水仪 美国Millipore公司；N-EVAP 112水浴氮吹仪 美国OA公司；KQ-500E超声波清洗器 昆山超声仪器有限公司；KDC-40低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猪肉饼的制备

去除样品肉中可见脂肪及筋膜，放入绞肉机制成肉糜，搅拌均匀后，称取40 g肉糜制作不同直径（4、6、8、10 cm）圆形肉饼，于4 ℃的冰箱中保存6～8 h备用。

1.3.2 样品前处理

称取1 g待测样品于50 mL离心管中，加入4 mL 1.0 mol/L NaOH溶液和6 mL乙腈，均质30 s后加入1.5 g NaCl，涡旋2 min，4 500 r/min离心5 min，将上层溶剂转移到15 mL玻璃管中，残渣中再加入4 mL乙腈萃取1次，合并乙腈层，在40 ℃下氮吹至约2 mL，待净化。

预先用甲醇、超纯水、体积分数1%甲酸溶液各3 mL，将StrataTM-X-C固相萃取柱活化和平衡。将提取液全部通过StrataTM-X-C固相萃取柱（60 mg/3 mL）。依次用3 mL体积分数0.1%甲酸、3 mL超纯水和3 mL甲醇淋洗，再用4 mL甲醇-氨水（90∶10，V/V）洗脱，洗脱液在40 ℃下氮吹至干，用流动相定容至1.0 mL，涡旋30 s，过0.22 μm滤膜，待超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测。

1.3.3 杂环胺检测

标准溶液的配制：分别称取各标准品适量，用甲醇溶解并定容，配成单标储备液；再用甲醇稀释，配制成质量浓度为1.0 mg/L的混合标准溶液。使用时，用初始流动相（1 mmol/L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）-乙腈，95∶5，V/V）配制成不同浓度的混合标准工作液。

色谱条件：色谱柱Agilent Poroshell 120-EC-C18（150 mmh2.1 mm，2.7 μm），柱温30℃；流动相A：1 mmol/L乙酸铵溶液（含0.05%乙酸）；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1 min，90% A、10% B；1～6.5 min，90%～80% A、10%～20% B；6.5～7.5 min，80%～5% A、20%～95% B；7.5～9.0 min，5% A、95% B；9.0～10 min，5%～90% A、95%～10% B；10～12 min，90% A、10% B。进样量5 μL；流速0.3 mL/min。

质谱条件：电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源，正离子模式；喷雾电压3.5 kV；毛细管温度320 ℃；喷雾温度250 ℃；鞘气压力45 arb；辅助气压力8 arb；S-LensRF电压50 V；喷雾气/碰撞气：氮气。利用正离子Full MS模式进行扫描，Full MS一级全扫描范围m/z50～650，分辨率70 000，自动增益控制106，自动注入时间100 ms；dd-MS2二级扫描自动增益控制105，分辨率17 500，自动注入时间60 ms，各化合物的归一化碰撞能量设为80%、100%、120%，动态排除设为8 s。

1.3.4 基质效应计算

选取3种不同油煎条件制备的猪肉饼样品混合均匀，添加不同浓度的混合标准工作溶液后，按照1.3.2节前处理后上机，以目标物定量离子峰面积为纵坐标，以标准品质量浓度为横坐标进行回归分析，获得基质标准曲线；以初始流动相作为纯溶剂，配制不同浓度混合标准工作溶液，获得纯溶剂标准曲线。基质效应为基质标准曲线斜率与纯溶剂标准曲线斜率比值。

1.3.5 油煎猪肉饼的制备

将上述制备的猪肉饼（直径8 cm）置于平底不粘锅中煎制，固定油煎温度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察玉米油、花生油、菜籽油、橄榄油、大豆油5种家庭常用油对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响；使用花生油，固定油煎温度225 ℃，考察不同油煎时间（1、2、3、4、5 min）对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响。使用花生油，固定猪肉饼直径8 cm、油煎温度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察不粘锅、电磁锅、铁锅和复合涂层锅4种锅具对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响。使用花生油、平底不粘锅，固定油煎温度225 ℃，加工5 min（2.5 min翻面），考察肉饼直径（4、6、8、10 cm）对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺含量的影响。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件处理数据，每组实验平行测定3次，结果以 fs表示；采用SPSS 21.0软件进行数据统计学分析，采用方差分析、Duncan多重范围检验差异显著性分析；使用Origin 8.1软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 6种氨基咔啉类杂环的测定

6种氨基咔啉类杂环胺在ESI+模式下均得到[M+H]+的准分子离子峰。根据获得的6种氨基咔啉类杂环胺的一级质谱以及二级碎片离子质谱，得到6种氨基咔啉类杂环胺分子母离子分子质量的测定值和理论值、质量精确度。由表1可知，6种氨基咔啉类杂环胺的质量偏差绝对值均小于3.0，符合欧盟指令2002/657/EC中的定性确证准则。根据保留时间与准确相对分子质量可实现对6种氨基咔啉类杂环胺的准确定性。

2.2 方法性能

以3 倍信噪比确定方法检出限，以10 倍信噪比确定方法定量限。以目标物定量离子峰面积为纵坐标，以标准品质量浓度为横坐标进行回归分析，得到6种氨基咔啉类杂环胺的线性回归方程。由表1可知，MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2这6种氨基咔啉类杂环胺在相应质量浓度范围内呈良好线性关系，相关系数（R2）均大于0.996。方法检出限为0.02～0.15 μg/kg，定量限为0.05～0.5 μg/kg，表明方法具有较好的灵敏度。方法基质效应为0.93～1.16，基本可以忽略。

表1 6种氨基咔啉类杂环胺的准确质量数测定数据和方法性能参数Table 1 Accurate mass number data of six amino-caroline HAAs and analytical figures of merit of the proposed method

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的确定

杂环胺结构中的氨基或环上的氮原子具有不同的解离常数（pKa），这使得6种氨基咔啉类杂环胺的pKa值存在较大差异，MeAαC、AαC、Harman、Norharman、Trp-P-1和Trp-P-2的pKa值分别为7.08、6.79、8.62、7.85、10.88和10.59。提取溶剂的选择需要同时兼顾不同非极性的杂环胺。此外，肉制品富含油脂，应尽量减少油脂的干扰。通过分析发现，极性过强的甲醇会提取出样品中较多油脂等杂质，提取溶液呈黏稠状，固相萃取净化时容易堵塞固相萃取柱，增加后续净化难度[25]。二氯甲烷和乙酸乙酯对杂环胺类化合物回收率较低，大部分目标杂环胺的回收率低于30%。而乙腈极性范围大，其分子较小，具有较强的组织穿透能力和良好的沉淀效果，尤其是对脂肪、蛋白质类化合物，对6种氨基咔啉类杂环胺类化合物均有较高的提取率，提取溶液氮吹浓缩后残留物较少。适当引入碱性水溶液有利于样品分散，使目标化合物被更充分提取。因此，考察0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mol/L NaOH溶液对目标杂环胺的提取效率。由图1A可知，随着NaOH浓度的增大，6种氨基咔啉类杂环胺的回收率整体呈上升趋势，在NaOH浓度1 mol/L时回收率最佳，目标杂环胺的回收率均在68%以上，且在实验过程中观察到1 mol/L NaOH的提取溶液在氮吹浓缩时浑浊度最弱，氮吹浓缩后残留物更少，基质效应低，表明提取出的油脂最少；原因可能是碱液加入使部分油脂皂化水解，起到一定的除脂效果[26]。但提取体系NaOH浓度过高（2 mol/L）时，则容易出现乳化，不利于分层，影响目标物在乙腈层的分配，从而降低了杂环胺的提取回收率。最终采用乙腈-1 mol/L NaOH溶液作为提取溶剂。

图1 NaOH浓度（A）、NaCl添加量（B）、固相萃取柱（C）和洗脱液（D）对6种氨基咔啉类杂环胺提取回收率的影响Fig.1 Effects of NaOH concentration (A), NaCl addition (B), solid phase extractioncartridges (C) and eluents (D) on the recoveries of six amino-carboline HAAs

2.3.2 NaCl添加量的确定

研究发现，萃取过程中添加1 g NaCl可显著提高1 g汉堡肉饼样品中杂环胺的萃取效率，而添加超过1 g NaCl，盐析效果并没有显著提高[27]。由图1B可知，不添加NaCl时，6种氨基咔啉类杂环胺中只有MeAαC、Harman和Norharman的回收率在60%以上，其余均在60%以下，表明不添加NaCl时目标杂环胺的提取效果较差。添加1.0 g NaCl时，杂环胺提取回收率显著提高，但AαC、Trp-P-1这两种杂环胺的回收率仍低于70%。NaCl添加量1.5 g时，6种氨基咔啉类杂环胺的提取回收率均相对较高；NaCl添加量增加到2.0、3.0 g时，大多数杂环胺的回收率变化不明显。因此，最终选择添加1.5 g NaCl以获得较优的目标杂环胺回收率。

2.3.3 固相萃取柱的选择

比较StrataTM-X-C柱（60 mg/3 mL）、Cleanert PCX柱（60 mg/3 mL）、Waters Oasis MCX柱（60 mg/3 mL）3种阳离子交换型固相萃取柱对6种氨基咔啉类杂环胺提取回收率的影响。按照固相萃取柱填料的吸附原理优化各自上样溶液、淋洗和洗脱溶液。由图1C可知，采用StrataTM-X-C柱净化，6种氨基咔啉类杂环胺均可获得较好的净化效果，回收率在70%以上，仪器检测显示基质抑制效应降低。StrataTM-X-C柱为键合了苯磺酸官能团的强阳离子交换柱，与杂环胺上的—N+可形成较强的离子键，可以用水和甲醇充分淋洗进行除杂，提高目标杂环胺的提取回收率。采用Cleanert PCX柱和Waters Oasis MCX柱净化，仪器检测显示基质抑制效应较强，目标杂环胺回收率较低。综上所述，最终采用StrataTM-X-C固相萃取柱对提取溶液进行净化。

2.3.4 洗脱液的确定

由图1D可知，当氨水体积分数10%时，除AαC、Trp-P-2，其他4种氨基咔啉类杂环胺的提取回收率显著增加，并达到最佳，而氨水体积分数达到20%和30%时，回收率显著降低。在甲醇-氨水体积比90∶10，杂环胺整体回收率为64%～91%，优于体积比为95∶5、80∶20和70∶30时的整体回收率。因此采用甲醇-氨水（90∶10，V/V）作为洗脱液。

综上，最终确定6种氨基咔啉类杂环胺的最优提取和净化条件为：1 g样品中添加1.5 g NaCl、10 mL 1 mol/L NaOH溶液-乙腈（4∶6，V/V）提取，StrataTM-X-C柱净化，甲醇-氨水（90∶10，V/V）洗脱。

2.4 油种类对油煎猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响

如表2所示，不同油对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成具有显著影响，橄榄油煎制猪肉饼中6种杂环胺生成总量（4.37 μg/kg）低于其他4种油煎制猪肉饼。这可能是因为相比玉米油、花生油、菜籽油、大豆油，橄榄油中含有多酚等抗氧化物质更丰富，这些物质可通过清除参与杂环胺形成途径中的自由基从而抑制杂环胺的生成[24]。有研究发现橄榄油、葵花籽油和榛子油等对杂环胺形成能起到抑制效果，原因可能是这几种油中不饱和脂肪酸较多，会对杂环胺形成过程中的美拉德反应造成干扰，破坏反应进行，从而发挥抑制杂环胺形成的效果；也有研究认为是由于其中的共轭亚油酸具有较强的抗氧化作用，从而对杂环胺的形成产生抑制作用[28]。

表2 油种类对油煎猪肉饼中杂环胺生成的影响Table 2 Effects of cooking oil types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.5 油煎时间对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响

如表3所示，油煎时间对猪肉饼中杂环胺的产生具有显著影响，随着油煎时间的延长，Trp-P-2、MeAαC和Norharman 3种杂环胺的生成量显著增加（P＜0.05）。Dong等[29]研究发现230 ℃煎炸16 min牛肉馅饼中Norharman和Harman的含量分别约为煎炸4 min样品的18 倍和12 倍。

表3 油煎时间对油煎猪肉饼中杂环胺生成的影响Table 3 Effect of pan-frying time on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.6 油煎锅具对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响

如表4所示，采用不同锅具油煎猪肉饼生成的杂环胺总量依次为不粘锅＜电磁锅＜铁锅＜复合涂层锅的趋势。使用不粘锅（聚四氟乙烯涂层）和电磁锅油煎过程中肉饼不粘连且受热均匀，从而减少杂环胺的生成[10]。

表4 油煎锅具对油煎猪肉饼中杂环胺生成的影响Table 4 Effect of pot types on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

2.7 肉饼直径对猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺生成的影响

肉的表面积和形状也是影响热加工猪肉饼中杂环胺类型和含量的重要因素之一[30]。如表5所示，油煎猪肉饼中杂环胺的种类及含量随着猪肉饼直径的减小显著变化（P＜0.05）。在直径8 cm和10 cm的肉饼中仅检测到Norharman，含量分别为0.89 µg/kg和0.52 µg/kg。直径6 cm时检测到3种氨基咔啉类杂环胺，分别为AαC（0.05 µg/kg）、Harman（0.06 µg/kg）和Norharman（1.48 µg/kg），但当直径为4 cm时，6种氨基咔啉类杂环胺均有检出，总含量为29.33 µg/kg，远高于10 cm的0.52 µg/kg。因此，肉制品尺寸对杂环胺生成含量有重要影响，猪肉饼直径越小，杂环胺生成含量越高。

表5 肉饼尺寸对猪肉饼中杂环胺含量的影响Table 5 Effect of patty thickness on the formation of HAAs in pan-fried pork patties μg/kg

3 结 论

本研究首先建立一种超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱同时测定热加工猪肉饼中6种氨基咔啉类杂环胺的检测方法。优化后，1 g样品选用1 mol/L NaOH溶液-乙腈作为提取试剂，添加1.5 g NaCl进行萃取，采用StrataTM-X-C柱净化，用甲醇-氨水溶液（90∶10，V/V）洗脱。在上述条件下，6种氨基咔啉类杂环胺全部实现分离，且峰型良好。方法具有良好的稳定性和准确性。进一步探究油煎条件对猪肉饼中杂环胺生成的影响。结果表明，油种类对杂环胺生成影响显著，菜籽油煎制猪肉饼中杂环胺含量最高，橄榄油煎制猪肉饼中最低。采用不同锅具煎制所产生的杂环胺含量为复合涂层锅＞铁锅＞电磁锅＞不粘锅；不同尺寸猪肉饼煎制后产生的杂环胺含量也不同，猪肉饼直径越小，杂环胺生成量越高。研究结果可为油炸肉制品中杂环胺的检测和减控提供数据支撑和方法指导。