贵式肉品中乳酸菌的选育及其对发酵里脊火腿风味品质的影响

周 洁，李洪英,2，朱秋劲,2,*，万 婧,2，周 颖，胡 可，田志擎，况于光，李 晴

（1.贵州大学酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550005；2.贵州大学生命科学学院，山地生态与农业生物工程协同创新中心，高原山区动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵阳吉品风味食品有限公司，贵州 贵阳 550018）

发酵肉制品是指在微生物或酶作用下，自然或人为控制条件形成的一类具有特殊风味、质地和色泽，且能保存较长时间的高档肉制品[1]。里脊火腿是一种低温发酵肉制品，发酵周期短，不仅有肉纤维的弹性，且较高温肉制品，其营养和风味更丰富，肉类蛋白质和脂肪经微生物发酵作用被水解为更易被人体吸收的小分子物质，提高人体对肉制品中营养成分的利用[2]。我国传统发酵肉制品制作周期长，生产季节性、区域性较强，标准化生产不足，因此，开发直投式发酵剂不仅有助于缩短生产周期，实现规模化生产，而且可以提升产品的安全性，抑制腐败微生物和病原微生物生长，提高产品的稳定性、感官质量和保存性[3]。

乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，可通过多种途径抑制某些腐败菌的生长，如产生苯乳酸、乙酸或乳酸等有机酸而导致环境pH值降低，从而抑制不耐酸细菌的生长；其次乳酸菌能产生具有抑菌活性的代谢产物，即细菌素（Nisin、罗氏菌素、片球菌素、链球菌素等）以及类细菌素[4]；同时其产生的有机酸既可以延长产品货架期还可以增加肉制品的风味[5]。肉制品生产中使用的乳酸菌主要有植物乳杆菌、清酒乳杆菌、戊糖片球菌等，这些菌株不具有毒性因子，如氨基酸脱羧能力、产肠毒素、溶血性或脱氧核糖核酸酶活性[6]。

将植物乳杆菌单一或混合发酵可提高肉制品的品质和安全性。潘晓倩等[7]从腌腊肉中筛选得到植物乳杆菌10M-7应用于腊肠，降低了有害菌数量。单菌发酵还能改善香肠感官性状[8]，抑制产品氧化酸败[9]，生产功能性干腌香肠[10]。Dicks等[11]将植物乳杆菌423和弯曲乳杆菌D126混合发酵可有效抑制意大利香肠中单核细胞性李斯特菌的生长；陈一萌等[12]研究表明植物乳杆菌和戊糖片球菌共同发酵牦牛肉可提升产品嫩度；Hu Yingying等[13]发现植物乳杆菌混合发酵还能改善干腌香肠口感。此外，添加植物乳杆菌可降解亚硝酸盐[14]，降低产品中生物胺含量[15]，水解肌肉蛋白促进肉制品风味形成[16-18]，提高低盐发酵肉制品安全性[19]。

本研究从贵式传统发酵肉和腌腊制品中筛选得到强蛋白质降解能力的植物乳杆菌SJ-4，并应用于发酵里脊火腿，探讨该菌株对火腿色泽、质构和风味的影响，以期为本土微生物资源的挖掘利用、肉类直投式发酵剂的研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

威宁火腿 毕节市正文食品加工厂；盘县火腿贵州杨老奶食品有限公司；锦屏酸肉购于杨仪文酱菜作坊；榕江酸肉购于榕江农贸市场；黔五福风肉、黔五福香肠 贵州五福仿食品股份有限公司；遵义香肠、风肉遵义黔之农食品有限公司；凯里风肉、凯里香肠购于凯里市兴联民种养殖农民专业合作社；毕节风肉为农家自制；猪里脊、脱脂乳、食盐、白糖、胡椒粉等均购于贵阳花溪沃尔玛超市。

MRS琼脂培养基、MRS肉汤培养基、PY培养基、PYG液体培养基（在PY培养基中添加10 g/L葡萄糖）上海博微生物科技有限公司；细菌微量生化鉴定管（赖氨酸脱羧酶肉汤、L-精氨酸双水解酶、氨基酸脱羧酶对照、H2S生化管、V-P半固体琼脂） 青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢钠、硫酸铵、液体石蜡、甘油、革兰氏染色试剂、L-精氨酸、α-萘酚、氢氧化钾、氯化钠、亚硝酸盐、过氧化氢、硝酸钾、Griss试剂、甲基红、石蕊、纳赛尔试剂、三丁酸甘油酯、葡萄糖、吐温-80、溴甲酚紫（均为分析纯）天津市致远化学试剂有限公司；2hTaqPCR Master Mix天一辉远生物科技有限公司；酪蛋白 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FB超净工作台、YM-COS-100B恒温摇床、YM-08X无菌均质机 上海豫明仪器责任有限公司；AR224CN电子分析天平 美国Ohaus仪器有限公司；SPX-300生化培养箱 浙江托普云农科技股份有限公司；LS-75LD全自动高压灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；Seven2GOTMpH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Thermal Cycler2720聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 美国Applied Biosystem公司；DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂；L5S紫外分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；SpectraMAX190酶标仪 美国Molecular Devices公司；XHF-DY高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；TA.TOUCH质构仪 上海保圣科技有限公司；NH350便捷式电脑色差仪 安捷伦科技有限公司；SA402B电子舌 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；Pegasus GC-HRT 4D+全二维气相色谱高通量高分辨质谱联用仪 美国力可公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化与保藏

肉样剪碎成米粒大小，称取10 g，加入90 mL无菌生理盐水，经无菌均质机拍打后作10 倍稀释，选取3个适当稀释浓度分别吸取200 μL涂布于MSR琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h，根据《微生物学实验手册》[20]对符合条件的单菌落进行初步筛选并分离纯化，反复划线直至革兰氏染色镜检结果无杂菌，停止分离纯化，将纯化的革兰氏阳性菌株4 ℃斜面保存，同时保存于-80 ℃ 40%甘油管中。

菌株活化：吸取200 μL甘油管中的菌液至10 mL MRS肉汤培养基，37 ℃活化3次得到107CFU/mL菌液，用于后续实验。

1.3.2 菌株初筛

蛋白降解实验：称取10 g肉样于离心管中，加入200 mL 50 mmol/L pH 7.5预冷的磷酸盐缓冲液，12 000 r/min匀浆3次后于4 ℃、8 000 r/min离心15 min，重复3次，收集沉淀并冷冻干燥成粉末，得到肌原纤维蛋白[21]。将新鲜碎肉分散在10 倍体积的磷酸盐缓冲液（40 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4、50 mmol/L NaCl，pH 6.0）中，12 000 r/min均质30 s后12 000 r/min、4 ℃离心15 min，用纱布快速过滤收集上清液，加入硫酸铵至饱和，连续搅拌析出肌浆蛋白，10 000 r/min、4 ℃离心15 min收集沉淀，冷冻干燥成粉末，得到肌浆蛋白[22]。在MRS培养基中加入1%上述预先提取的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，115 ℃灭菌后使用7 mm打孔器打孔，加入100 μL菌液，37 ℃培养24 h测量降解圈直径。

产酸实验：吸取400 μL菌液加入20 mL MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h，测定pH值。

发酵葡萄糖产气实验：在1 L PY培养基中加入30 g葡萄糖、0.5 mL吐温-80、1.4 mL 1.6 g/100 mL溴甲酚紫，分装10 mL试管后放入倒置的杜氏小管，灭菌后接入200 μL菌液，使用无菌石蜡液封，37 ℃恒温培养24 h，若杜氏小管中有气泡为阳性，无气泡为阴性[23]。

1.3.3 菌株复筛

1.3.3.1 菌株生产适应性

耐盐性实验：将活菌数107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接种量接入含6 g/100 mL NaCl的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h测定OD600nm[24]。

耐亚硝酸盐实验：将活菌数107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接种量接入含150 mg/kg NaNO2的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h测定OD600nm[24]。

耐酸实验：将活菌数107～108CFU/mL菌液活化3 代后按2%接种量接入pH 5.0的MRS肉汤培养基，37 ℃培养24 h测定其OD600nm[24]。

1.3.3.2 菌株安全性

氨基酸脱羧酶活性实验：分别吸取300 μL菌液于细菌微量生化鉴定管（赖氨酸脱羧酶肉汤、L-精氨酸双水解酶、氨基酸脱羧酶对照）中，接种后覆盖300 μL无菌液体石蜡，37 ℃培养24 h，若实验管紫色、对照管黄色，则为阳性反应；若实验管和对照管均为黄色，则为阴性反应。

1.3.3.3 菌株作为肉用发酵剂的评定

硝酸盐还原酶实验：在MRS培养基中加入0.2%硝酸钾，将纯菌落划线后37 ℃培养48 h，滴入Griess试剂A液（150 mL 20%盐酸中加入0.5 g对氨基苯磺酸）、B液（0.2 g盐酸萘乙二胺溶于100 mL蒸馏水），观察菌落周围是否出现红圈并测量红圈直径[24]。

产氨实验：将0.5 g NaCl、0.5 g精氨酸溶于100 mL脱脂牛乳中，接入0.2%的菌液，37 ℃培养24 h后滴入1 滴纳赛尔试剂，有黄色沉淀为阳性，无沉淀为阴性[24]。

产黏性实验：将菌落接种于MRS培养基，37 ℃培养24 h，挑取单个菌落进行观察。

产H2S实验：将菌落穿刺于H2S细菌微量生化鉴定管，37 ℃培养24 h，若穿刺线变黑呈伞状生长则为阳性，清晰无变化为阴性。

脂肪酶分解活性实验：MRS琼脂培养基121 ℃灭菌20 min后冷却至80 ℃，加入1%灭菌的三丁酸甘油酯，得到脂肪酶培养基，挑取单菌落接种于该培养基中，37 ℃培养48 h，观察菌落周围是否出现降解圈。

1.3.3.4 生理生化鉴定

石蕊牛奶实验：在100 mL脱脂牛乳中加入4 mL 25 g/mL石蕊试剂，分装10 mL试管灭菌后接入0.2%菌液37 ℃培养2 d观察石蕊牛奶是否凝固[23]。

接触酶实验（过氧化氢实验）：挑取单个菌落至PYG培养基中，滴加3%过氧化氢，若有气泡生成为阳性，无气泡为阴性[25]。

甲基红实验：接种2%菌液至PYG培养基培养24 h后滴入甲基红指示剂，变红为阳性，变黄为阴性。

乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）：挑取单个菌落穿刺V-P半固体琼脂细菌微量生化鉴定管，37 ℃培养24 h，滴入试剂A（6%α-萘酚-乙醇溶液）6 滴、试剂B（40% NaOH溶液）2 滴，静置30 min后观察，穿刺线无明显变化为阴性；穿刺线变红呈伞状生长为阳性。

1.3.4 菌株SJ-4最适生长条件的确定

将菌液以4%接种量接种于MRS肉汤培养基，分别在17、22、27、32、37、42、47 ℃下恒温培养24 h，测定菌液OD600nm，确定菌株最适生长温度[26]。将菌液以4%接种量分别接种于pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的MRS液体培养基中，37 ℃培养48 h，每12 h测定一次菌液OD600nm，确定菌株最适生长pH值。

1.3.5 菌株SJ-4生长曲线和产酸曲线的测定

将菌液以4%接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，每隔2 h测定一次OD600nm和pH值。

1.3.6 菌株SJ-4 16S rDNA分子生物学鉴定

将筛选出的菌液使用细菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）扩增细菌16S rDNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳20 min，送至武汉天一辉远生物科技有限公司测序，测序后进入NCBI网站BLAST程序进行同源性比对，使用MEGA-X软件构建系统发育树。

1.3.7 植物乳杆菌SJ-4对发酵里脊火腿质构及色差的影响

发酵里脊火腿的制作：将市售里脊使用少量高粱酒去腥，风干后加入2.5%食盐、0.01%亚硝酸钠、0.15%异抗坏血酸钠、0.8%花椒粉、0.5%三聚磷酸钠、0.8%白糖、0.5%白胡椒、0.5%五香粉（均按肉质量计），0～4 ℃腌制24 h后使用无菌注射器按107CFU/g接入SJ-4菌液，真空滚揉30 min后于30 ℃发酵24 h，结束后50 ℃烘烤4 h再真空包装。以不接菌液为对照组。

质构测定：去除火腿表面，切成2 cmh2cmh2 cm立方体，使用TA/36探头，测前速率1 mm/s，测后速率1 mm/s，压缩率50%，触发力5 g，间隔时间2 s，测定硬度、弹性、黏聚性、咀嚼性。

色差测定：去除火腿表面，切成长、宽均为3 cm片状，测定红度值（a*）、黄度值（b*）、亮度值（L*），同时使用E*评价，，减少色泽误差。

1.3.8 植物乳杆菌SJ-4发酵里脊火腿电子舌分析

切除火腿表面，取10 g加入100 mL蒸馏水使用高压均质机搅碎，30 ℃浸提3 h后于冷冻离心机4 ℃、6 000 r/min离心15 min后取上清液20 mL，加入60 mL蒸馏水稀释，倒入电子舌样品杯中测定，取中间测定数据进行分析。

1.3.9 植物乳杆菌SJ-4对里脊火腿风味的影响

取5 g样品加入20 mL顶空进样瓶中，使用老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头于60 ℃萃取30 min。

色谱条件：进样口温度250 ℃，不分流进样，ffap色谱柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），载气高纯氦气，流速1 mL/min。升温条件：40 ℃保持3 min，8 ℃/min升至230 ℃，保持5 min，仪器采用一维模式。

质谱条件：电子电离源，阳离子模式，电子轰击能量70 eV，离子源温度210 ℃，传输线温度250 ℃，质谱分辨率25 000，质量范围33～450 u。

采用NIST 17和Wiley 9结合保留指数同时检索，利用Leco公司软件进行化学计量学分析确定化合物（匹配度大于800）。

1.4 数据处理

每组实验设置3个平行，结果表示为 fs，采用Excel软件处理数据，Origin 2019软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛结果

如表1所示，贵州发酵肉制品分离纯化的乳酸菌中有37 株菌能降解肌原纤维蛋白，48 株菌能降解肌浆蛋白，对这些菌株进行产酸和发酵葡萄糖产气实验。

表1 降解蛋白质菌株的初筛Table 1 Screening of protein-degrading strains

产酸能力是评价乳酸菌作为肉制品发酵剂的重要因素，与发酵肉的品质和安全性密切相关，其产酸能力应满足24 h液体培养后pH≤3.8[27]。剔除部分异型乳酸菌，从降解蛋白质的菌株中选取满足上述条件16 株菌SJ-1、SJ-4、SJ-5、SJ-6、SJ-7、SJ-8、SJ-9、SJ-10、SJ-11、SJ-14、SJ-16、SJ-17、RS-1、RS-16、RS-18、RS-20进行研究。

2.2 菌株初筛结果

2.2.1 菌株耐盐能力

发酵肉制品中食盐添加量一般为2%～6%，因此发酵菌株需有一定耐盐性[28]。由图1可知，16 株乳酸菌在含6 g/100 mL NaCl的MRS肉汤培养基中均可生长，其中SJ-4 OD600nm显著高于其他菌株（P＜0.05），耐盐性较好。乳酸菌等细菌可以积累甜菜碱和四氢吡啶抵御外界渗透压胁迫[29]，赋予菌株耐盐性。此外，嗜盐菌相关酶类等功能蛋白在氨基酸组成和结构等方面也具有适应高盐环境的特征。除SJ-1、SJ-4外，其他菌株OD600nm较低，这是因为在较高NaCl质量浓度下微生物细胞发生质壁分离，结构损伤，菌株生理代谢活动紊乱，生长缓慢或死亡[30]。

图1 菌株对6 g/100 mL NaCl耐受性Fig.1 Tolerance of strains to 6 g/100 mL of NaCl

2.2.2 菌株耐亚硝酸盐能力

发酵肉制品中添加一定量的亚硝酸盐有助于产品色泽的形成并抑制肉毒杆菌的生长，本实验选取GB 2760ü 2014《食品添加剂使用标准》中规定的肉制品中亚硝酸盐最大使用量150 mg/kg。由图2可知，在添加150 mg/kg亚硝酸盐培养基中，16 株菌均能生长，即在较高NaNO2水平下菌株可以自身调节，这可能与菌株自身的相容性溶质调控系统、糖酵解关键酶调控系统、胞内离子平衡等耐盐机制有关[31]。其中SJ-4、SJ-11菌株的OD600nm明显高于其他菌株。

图2 菌株对150 mg/kg NaNO2耐受性Fig.2 Tolerance of strains to 150 mg/kg of NaNO2

2.2.3 菌株耐酸性

肉用发酵剂菌株除需具备耐盐、耐亚硝酸盐特性外，还需在pH 5.0条件下有一定耐受力[32]。由图3可知，pH 5.0下16 株菌均能生长，SJ-4菌株OD600nm显著高于其他菌株（P＜0.05）。乳酸菌的耐酸机制现多倾向于质子泵理论[33]，即在较低pH值环境下，菌株通过质子原动力透性酶转移系统提高细胞内碱性，防止低pH值环境引起的代谢紊乱。

图3 菌株对pH 5.0耐受性Fig.3 Tolerance of strains to pH 5.0

2.2.4 菌株发酵特性及生理生化鉴定

发酵肉制品中低含量的生物胺对健康影响较小，但摄入较高含量的生物胺可能造成头痛、呼吸紊乱甚至死亡[34]。有研究表明添加植物乳杆菌能降低肉制品发酵过程中生物胺含量[35-36]。因此菌株需无氨基酸脱羧酶活性，且不产NH3、H2S、H2O2等有害气体，不产黏性、石蕊牛奶实验阳性、甲基红实验阴性、V-P实验阴性。由表2可知，初筛的16 株菌均满足上述要求。

表2 菌株发酵特性与生理生化鉴定Table 2 Fermentation characteristics and physiological and biochemical identification of strains

乳酸菌中能够降解蛋白质的菌属较少，部分植物乳杆菌具有降解蛋白质的能力，发酵过程中乳酸菌降低pH值促进纤维蛋白凝固，提高终产品硬度、黏度，利于切片。脂类是发酵肉制品风味前体，脂类氧化产物对发酵肉制品风味的形成具有重要作用[37]。然而，过氧化反应会导致肉类风味劣变[38]，因此，为控制肉制品的脂质氧化，有必要筛选不产生脂肪降解圈的菌株，以避免发酵过程中脂肪分解。由表2可知，所有菌株均不分解脂肪，SJ-4、SJ-8、SJ-17分解蛋白质能较强。

根据蛋白质降解、生理生化特性、生产适应性、安全性实验结果，菌株SJ-4适合高盐和亚硝酸盐环境生长，可作为发酵剂潜在菌株进行后续实验。

2.3 菌株SJ-4最适生长条件及生长曲线、产酸曲线

由图4A可知，在20～45 ℃范围内，随着温度上升菌株SJ-4 OD600nm先增加后减小，其最适温度为37 ℃，此时OD600nm为1.584。在47 ℃时，因高于乳酸菌最适生长温度范围30～45 ℃，OD600nm迅速下降，菌株代谢活动受抑制并丧失活性。

图4 菌株SJ-4最适温度（A）、最适pH值（B）及生长曲线和产酸曲线（C）Fig.4 Optimal temperature (A) and pH (B), growth curve and acid production curve (C) of strain SJ-4

由图4B可知，菌株SJ-4最适pH值为6.0～7.0，培养12 h SJ-4在不同pH值下活力均较高，相同pH值下，随着培养时间延长，OD600nm总体降低，表明环境中营养物质比例失调，菌株生长进入稳定期和衰亡期，对外界不良环境敏感。在pH 6.0下培养24 h的OD600nm最高，为1.611。在较高和较低pH值下菌株SJ-4 OD600nm均较低，可能是偏酸或偏碱环境影响细胞内外电荷平衡，细胞膜通透性改变，营养物质难以进入细胞，严重影响菌株的生长代谢[39]。

由图4C可知，菌株SJ-4在0～4 h内增长缓慢，此时处于延滞期，细胞合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成速度加快。SJ-4延滞期较短，6～10 h进入生长对数期，此时细胞平衡生长，分裂时间最短，酶系活跃、代谢旺盛。在培养10 h时，菌株OD值为1.515，达到较高菌体活性。此后随着营养物质耗尽、有害产物积累或环境条件失调，菌株SJ-4进入稳定期，生长缓慢，细胞处于正生负生长动态平衡中。

酸度是衡量菌株发酵产酸能力的重要指标[40]。由产酸曲线可知，10 h内菌株SJ-4 pH值由5.98降到4.08，产酸能力较强，此后pH值下降缓慢，在培养18 h时pH值降到3.80，已达到作为肉品发酵剂产酸的条件，培养到22 h，最低pH值可达3.73。较快的生长和产酸速率有利于菌株在发酵肉制品中快速生长产酸，从而抑制其他腐败微生物的繁殖[27]。

2.4 菌株SJ-4形态及16S rDNA分子生物学鉴定结果

如图5A所示，SJ-4在MRS培养基37 ℃培养48 h，菌落呈白色、圆形，表面湿润不透明，边缘整齐；将菌株SJ-4革兰氏染色后置于显微镜100 倍油镜下观察，如图5B所示，细菌呈杆状，宽0.6～0.7 μm、长1.0～3.2 μm，单个或成对排列，革兰氏阳性。

图5 菌株SJ-4菌落形态（A）与油镜检测结果（×100）（B）Fig.5 Colony morphology (A) and microscopic examination (× 100) (B) of strain SJ-4

SJ-4经16S rDNA测序后进入NCBI数据库中BLAST系统进行同源性比对，使用MEGA-X构建系统发育树，如图6所示。分离株SJ-4与植物乳杆菌亲缘关系最近，这与形态、生理生化、发酵特性结果鉴定一致，故SJ-4可判断为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。将菌株送至中国工业微生物菌种保藏中心CICC保藏，菌株编号CICC No.11119s。

图6 菌株SJ-4 16S rDNA序列系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strain SJ-4 based on 16S rDNA sequences

2.5 植物乳杆菌SJ-4对发酵里脊火腿色泽及质构的影响

由表3可知，经SJ-4发酵后，接种组L*大于自然发酵组，但无显著差异（P＞0.05），这是由于植物乳杆菌酸化使肌丝晶格收缩，改变光反射并增加亮度。a*、b*、E*差异显著（P＜0.05），使用SJ-4发酵后，火腿E*显著高于对照组，能较好保持火腿色度，这与徐玉宁等[41]的研究结果一致。乳酸菌代谢产物将亚硝酸盐还原生成一氧化氮，与肌红蛋白结合成亚硝基肌红蛋白，有助于火腿发色[42]。

表3 菌株SJ-4对发酵里脊火腿色泽及质构的影响Table 3 Effect of strain SJ-4 on color and texture of fermented loin ham

两组发酵里脊火腿样品的弹性、咀嚼性无显著差异（P＞0.05），硬度、黏聚性差异极显著（P＜0.01）。乳酸菌产酸能力较强，火腿pH值下降，加速了肉类蛋白变性和胶凝，且腌制过程中水分流失使火腿硬度增加，有利于火腿的切片。

2.6 植物乳杆菌SJ-4对发酵里脊火腿电子舌响应值的影响

由图7可知，PC1和PC2累计贡献率为88.4%，可以代表样品味觉的主要特征。实验组在酸味、收敛性、丰富度、苦味的贡献率高于对照组，可以区分两组样品，这是由于植物乳杆菌SJ-4发酵产生的有机酸等代谢产物赋予产品独特口感和风味。虽然苦味贡献较高，但味觉强度与阈值相关[43]，且适当苦味对火腿风味有益[44]。对照组在咸味、鲜味的贡献率较高，这可能是乳酸菌发酵一定程度上降低了实验组咸味感知，使对照组咸味较为明显，且腌制料赋予发酵里脊火腿一定鲜味。该结果表明实验组样品味觉强度整体优于对照组，乳酸菌发酵有利于发酵里脊火腿滋味的形成。

图7 发酵里脊火腿味觉值主成分双标图Fig.7 Principal component analysis biplot of taste values of fermented loin ham

2.7 植物乳杆菌SJ-4对发酵里脊火腿风味的影响

由表4可知，两组样品共鉴定出70种挥发性成分，其中酯类13种、醇类11种、烯烃22种、芳香烃4种、醛类6种、酮类5种、酸类2种、其他类7种。

表4 植物乳杆菌SJ-4发酵里脊火腿风味物质分析Table 4 Analysis of flavor substances in fermented loin hams with Lactobacillus plantarum SJ-4

续表4

发酵火腿风味成分中烯烃含量较多。烯烃是脂肪酸烷氧基均裂的产物[45]，一般认为烃类物质对火腿风味的贡献不大[46]。柠檬烯被认为是金华火腿中的主要风味化合物，赋予火腿甜味或柠檬香味[47]。在植物乳杆菌SJ-4作用下，火腿中芳香族化合物含量增加，芳香烃是美拉德反应产物，虽含量较少，但其风味阈值低，与烯烃相比，芳香烃对火腿风味更为重要，赋予火腿熟肉风味。

醛类是脂质氧化产物，具有脂肪香味，对肉类风味形成有重要影响。火腿中的线性醛、烯醛和二醛来源于不饱和脂肪酸氧化形成的过氧化物的裂解；支链醛类主要来源于氨基酸的氧化脱氨和脱羧。经植物乳杆菌SJ-4发酵后壬醛、辛醛等直链醛含量增加，其风味阈值较低，呈花香、果香，对火腿风味贡献较大[48]。

接种发酵后醇类物质含量增高，乙醇含量约占醇类总含量的34.4%，可能是植物乳杆菌SJ-4发酵过程中产生乙醇等次级代谢产物，同时代谢产生的有机酸促进脂肪氧化生成醛、烃、醇和酮类化合物[49]。醇类化合物具有较高的气味阈值，多呈脂肪、木质和草本味，但对火腿风味贡献较小。

酮类化合物通常与奶油、水果和烹饪等风味特征有关。植物乳杆菌SJ-4发酵后，由美拉德反应生成的3-羟基-2-丁酮含量高于对照组。3-羟基-2-丁酮是二乙酰前体，而二乙酰也可能是2-乳酸乙酯脱羧的副产物[50]，有研究认为2-酮类化合物有助于促进肉类风味的形成[51]。

经植物乳杆菌SJ-4发酵后在火腿中检出乙酸。乙酸是干腌火腿中检出含量最丰富的酸，酸类可以调节碱性化合物对火腿风味的不利影响。

酯类是醇类与游离脂肪酸的反应产物，主要通过微生物作用形成。实验组和对照组酯类总含量相同。有研究在成熟干腌火腿中发现低阈值酯类化合物，其来源于羧酸和醇的酯化作用[52]，可能赋予火腿一定水果香气。

3 结 论

以贵式发酵肉制品为原料，通过蛋白降解能力、产酸和产气实验对菌株进行初筛，对菌株安全性、生产适应性、肉用发酵剂潜力、生理生化实验进行复筛，得到1 株乳酸菌，经16S rDNA测序后鉴定为植物乳杆菌SJ-4。

SJ-4可降解蛋白质和促进产品风味的形成，对6 g/100 mL NaCl、150 mg/kg NaNO2有一定耐受力，不产NH3、H2S、H2O2，无氨基酸脱羧酶活性和分解脂肪能力，最适温度37 ℃，最适pH 6.0。在MRS液体培养基37 ℃培养4 h后进入对数期，培养18 h可使pH值由5.98降至3.80，达到肉制品发酵剂条件，有较好的生长能力和产酸能力。

将植物乳杆菌SJ-4应用于发酵里脊火腿，结果表明实验组火腿的a*、b*、E*与对照组差异显著（P＜0.05），但L*无显著差异，SJ-4发酵促进了火腿色泽的形成和稳定。实验组火腿硬度、黏聚性与对照组差异显著（P＜0.05），表明SJ-4接种有利于提高火腿的切片性；SJ-4接种后火腿滋味更丰富，醛类等特征风味含量增高，改善了产品风味品质。