缺血性卒中患者外周血白细胞环状RNA表达谱分析

戴正泽，王小珂，乔伟，黎宏斐，邱峰

脑卒中是严重危害人类健康的难治性疾病，已成为全球第二大致死性疾病。随着我国居民生活方式改变、人口老龄化加重，我国脑卒中发病率逐年上升，已成为致死、致残最主要的疾病之一[1]。其中缺血性卒中(IS)约占全部卒中的70%，具有高发病率、高死亡率、高致残率特点[2]。

以往研究[3-4]表明外周血中炎症细胞因子、一些微小RNA(miRNA)和白细胞与IS密切相关。脑缺血后，外周血白细胞被募集到缺血区域，通过阻塞微血管、释放生物活性物质和促炎因子等加重缺血性脑损伤，作为卒中后炎症反应的标志物，白细胞水平的升高与不良预后相关[5-8]。理解白细胞活化的分子机制，对抑制其参与的炎症反应减轻缺血性脑损伤、实现IS早期诊断及治疗评估具有重要意义。

而近年来生物学芯片技术在临床医疗中飞速发展，环状RNA(circRNA)又是各类疾病研究分子机理的热点关注。circRNA作为一类缺少5′帽和3′尾的封闭环状RNA，与传统线性RNA不同，封闭环装结构使其比线性RNA稳定，不易被核酸外切酶降解。越来越多的研究表明，circRNA在许多生物学过程和疾病发生发展中发挥着重要作用。如被发现在脑部大量表达circ-CDR1as，已被证实参与帕金森病、Alzheimer’s病等多种神经系统疾病[9]。然而circRNA在IS炎症反应中的作用尚不清楚。本研究利用circRNA芯片技术对IS患者白细胞中circRNA的表达谱进行分析，qRT-PCR验证差异表达的circRNA，采用生物信息学预测miRNA和相关信号通路探讨IS的分子机制及可能的早期生物学标志物。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2019年9月至2019年10月东部战区总医院神经内科诊治的4例急性IS患者(TOAST分型为小动脉闭塞型卒中，IS组)和4例对照者纳入研究。IS的诊断符合中华医学会神经病学分会制定的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[10]诊断要点，并经头颅CT/MRI确诊。对照组为年龄、性别、血管风险因素(高血压、糖尿病、高脂血症)相似，但无心血管疾病(卒中、外周血管疾病或冠心病)、感染(活动性或卒中前14 d内)、接受免疫抑制治疗、白血病、淋巴瘤的患者。纳入研究受试者的基本信息见表1，其中IS组外周血白细胞计数显著高于对照组(P<0.05)，梗死部位分别为右侧基底节区、左侧基底节区、右侧脑干、右侧侧脑室旁。

表1 IS组和对照组一般资料[ x±s,例(%),n=4]一般资料IS组对照组年龄(岁)66±5.867±6.2性别(男)2(50)2(50)高血压3(75) 4(100) 糖尿病1(25)1(25)高脂血症1(25)1(25)白细胞(×109个/L)9.83±6.31△6.32±2.35 注:与对照组比较△P<0.05

1.2 方法

1.2.1 白细胞分离 使用EDTA管采集4例IS患者(发病72 h内)和4例对照者外周血样品，使用TIANGEN红细胞裂解液分离白细胞，白细胞沉淀加1 ml Trizol(Invitrogen life technologies，Inc.)溶液重悬吸入1.5 ml EP管中，并放入-80 ℃冰箱中保持备用。

1.2.2 样本总RNA 的提取和质检 采用Trizol法提取样本总RNA，将所提取的总RNA进行质量检测，采用NanoDrop ND-1000 型分光光度仪测定样品在230 nm、260 nm、280 nm 波长的光密度值(OD)A230、A260、A280。计算A260/A280、A260/230比值，以A260/A280接近2.0(1.8～2.1)A260/230大于1.8作为合格标准，最后采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性和gDNA污染。

1.2.3 芯片检测 将上述RNA样本进行芯片检测，检测是由上海康成生物有限公司完成。使用RNAaseR(Epic centre， Inc.)去除线性RNA并富集circRNA。然后，使用随机引物法将富集的circRNA扩增并转录成荧光cRNA(Arraystar Super RNA Labeling Kit， Arraystar)。将标记的cRNA与Arraystar Human circRNA Array V2 (8x15K， Arraystar)杂交。清洗载玻片后，使用Agilent Scanner G2505C对阵列进行扫描。

1.2.4 芯片数据提取及分析 使用Agilent Feature Extraction软件(11.0.1.1版)分析采集的阵列图像。使用R软件limma包进行数据归一化和随后的数据处理。通过火山图筛选两组间显著差异表达的circRNAs，分层聚类分析显示样本间circRNAs的表达差异。

1.2.5 qRT-PCR验证差异表达的circRNA 总RNA逆转录得到cDNA模板，使用QuantStudio5实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems)进行扩增。qRT-PCR扩增条件：95 ℃，10 min；40个PCR循环[95 ℃，10 s；60 ℃，60 s(收集荧光)]，引物序列见表2，以β肌动蛋白作为内参进行标准化，2-△CT值计算circRNA的相对表达量。

表2 qRT-PCR引物序列引物名称功能序列(5′-3′)hsa_circ_0055412上调上游:TGATGCCACTGGACAGATGAA下游:CTCGCCTTGTTGCGTTCChsa_circ_0000817上调上游:ATTACGATGGCTCCCGACAA下游:CTTGATGTTTGTGCTCGGGAAhsa_circ_0039522下调上游:TTGGCTATGATGATGGAGTCTG下游:GCCTTGGTCTCCTCGTTCAThsa_circ_0017310下调上游:TGCTAAGAAGATACCACCAGACAT下游:ATCCATCTTGTGGTTCTATTTGChsa_circ_0079284下调上游:CCCTTGCCAGGAGTGTTCA下游:CCATTATGTTCTTTCCAGAGTCChsa_circ_0002083下调上游:GCCCTAGCTGGCTACACAGATAT下游:ATGCTTGAGACATCATTTCTTTGC

1.2.6 预测circRNA可能靶向的miRNA及分析生物学功能 使用Arraystar基于TargetScan和miRanda数据库制作的预测软件，预测与circRNA结合的miRNA。利用DIANA-miRPath[11]探索miRNA可能参与的信号通路，分析潜在生物学功能。

2 结 果

2.1 样本总RNA质量检测结果 样本RNA的OD A260/A280为1.81～1.96，OD A260/A230为1.82～2.21，浓度为143.05～605.92 ng/μl(表3)。琼脂糖凝胶电泳分析，可在18S、28S处观察到清晰的条带，RNA质量达标(图1)，进行后续的芯片筛选和qRT-PCR验证。

表3 样本总RNA质量检测结果样本编号ODA260/A280ODA260/A230浓度(ng/μl)体积(μl)质量(ng)通过或未通过C11.922.03402.70156040.50PassC21.921.84483.31157249.65PassC31.911.82295.12154426.80PassC41.861.93184.83152772.45PassT11.811.94143.05152145.75PassT21.962.21605.92159088.80PassT31.922.09307.761515388.00PassT41.851.93164.42152466.30Pass

图1 提取RNA的凝胶电泳

2.2 芯片检测结果 与健康对照相比，IS患者外周血白细胞中circRNA有6 619个上调、6 284个下调，93个有显著改变(P<0.05，FC>1.5)。其中28个上调，65个下调，如(图2、图3)所示。

图2 差异表达circRNAs火山图

图3 差异表达circRNAs分层聚类图

2.3 qRT-PCR验证结果 从前10个最显著上调和下调的circRNA中挑选2个上调circRNA(hsa_circ_0055412、hsa_circ_0000817)和4个下调circRNA(hsa_circ_0039522、hsa_circ_0017310、hsa_circ_0079284、hsa_circ_0002083)进行qRT-PCR验证，结果显示(图4)IS组hsa_circ_0000817表达明显上调，hsa_circ_0039522、hsa_circ_0079284、hsa_circ_0002083表达明显下调(均P<0.05)，与芯片结果一致；两组间hsa_circ_0055412、hsa_circ_0017310表达差异无统计学意义。

图4 qRT-PCR验证差异表达的circRNA

2.4 miRNA结合位点预测 使用Arraystar基于TargetScan和miRanda数据库制作的预测软件，预测与circRNA结合的miRNA，表列出每个circRNA最可能结合的前5个miRNA(表4)。筛选验证的6个circRNA中，3个下调的hsa_circ_0039522、hsa_circ_0079284、hsa_circ_0002083和1个上调的hsa_circ_0000817符合芯片检测结果。miR-15a-5p和miR-214-3p分别是hsa_circ_0039522和hsa_circ_0002083预测结合的miRNA。研究[12-13]显示IS患者外周血miR-15a-5p、miR-214-3p显著升高。由于IS组中显著改变的circRNA大多数是下调的，因此本研究对上述经验证为下调的3个circRNA利用DIANA-miRPath探索预测结合的15个miRNA可能参与的信号通路(图5)和GO富集分析(表5)，其中位于前十位信号通路分别为脂肪酸代谢、脂肪酸生物合成、细胞外基质-受体相互作用、肿瘤转录失调、转化生长因子(TGF)-β信号通路、Hippo信号通路、乙型肝炎、内质网蛋白质加工、赖氨酸降解、卵母细胞减数分裂。

表4 靶miRNA结合位点预测circRNA结合位点1结合位点2结合位点3结合位点4结合位点5hsa_circ_0055412miR-661miR-612miR-146b-3pmiR-484miR-762hsa_circ_0000817miR-149-3pmiR-328-5pmiR-449b-5pmiR-449amiR-762hsa_circ_0039522miR-615-5pmiR-15b-5pmiR-433-3pmiR-15a-5pmiR-1301-5phsa_circ_0017310miR-335-3pmiR-215-3pmiR-1301-3pmiR-19b-2-5pmiR-19b-1-5phsa_circ_0079284miR-153-5pmiR-525-5pmiR-125a-3pmiR-520a-5plet-7i-5phsa_circ_0002083miR-432-5pmiR-136-5pmiR-544amiR-612miR-214-3p

图5 信号通路

表5 GO富集分析分类注释号描述基因数目P值生物过程GO:0043687翻译后蛋白质修饰55<1e-325生物过程GO:0000278有丝分裂细胞周期150<1e-325生物过程GO:0006259DNA代谢过程201<1e-325生物过程GO:0007173表皮生长因子受体信号通路74<1e-325生物过程GO:0034655含核碱基化合物分解代谢过程231<1e-325细胞组分GO:0005654核质436<1e-325

续表分类注释号描述基因数目P值细胞组分GO:0005575细胞组分3716<1e-325细胞组分GO:0005829细胞溶质799<1e-325细胞组分GO:0043234蛋白质复合体1073<1e-325细胞组分GO:0043226细胞器2694<1e-325分子功能GO:0008092细胞骨架蛋白结合197<1e-325分子功能GO:0000988蛋白质结合转录因子活性170<1e-325分子功能GO:0044822多聚腺苷酸RNA结合446<1e-325分子功能GO:0003723RNA结合555<1e-325分子功能GO:0043167离子结合1487<1e-325

3 讨 论

前期研究[5]提示外周血白细胞参与急性IS后免疫应答反应，引起炎性细胞在缺血组织周围浸润。circRNA在急性IS炎症反应机制有待探讨，本研究通过筛选差异表达circRNA对可能的生物学标记物进行了预测。

基于Arraystar circRNA芯片对IS患者外周血白细胞进行分析，本研究筛选出上调的circRNA有6 619个、下调的有6 284个，93个circRNA表达有显著差异，其中28个上调，65个下调。从前10个最显著上调和下调的circRNA中，分别选取2个上调(hsa_circ_0055412、hsa_circ_0000817)和4个下调的circRNA(hsa_circ_0039522、hsa_circ_0017310、hsa_circ_0079284、hsa_circ_0002083)进行qRT-PCR验证。结果显示hsa_circ_0000817明显上调，hsa_circ_0039522、hsa_circ_0079284、hsa_circ_0002083明显下调，与芯片结果一致。提示这些circRNA可能参与了脑卒中后的炎症反应过程。

由于circRNA具有miRNA“海绵”作用，可通过与miRNA结合而抑制其活性，从而调控miRNA靶基因以发挥作用[14]。本研究对经过验证的3个下调circRNA进一步使用生物信息学方法预测与其靶向结合的miRNAs和相关信号通路。差异表达的上述circRNA可能参与细胞外基质-受体相互作用、TGF-β、Hippo等相关信号通路。研究[15]发现TGF-β能够抑制多种免疫细胞活性，此外其通过抗炎、抑制凋亡、减弱兴奋性毒性和促进神经血管再生等在脑缺血损伤中起重要的保护作用[16]。本研究预测hsa_circ_0039522通过靶向结合调控miR-15a。miR-15a和miR-16是两个高度保守的miRNAs，他们通过与共同的mRNA靶向结合而形成结构和功能簇(miR-15a/16-1簇)。IS时血清miR-15a和miR-16明显升高[12]。研究[17]证实miR-15a/16-1簇能靶向抑制TGF-β信号通路，这提示其可能通过激活多种免疫细胞加重脑缺血损伤。此外，miR-15a和miR-16还可通过靶向紧密连接蛋白加重血-脑屏障的破坏[18]，通过靶向血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子来抑制血管生成[19]。上述这些研究提示miR-15a与IS密切相关。本研究发现hsa_circ_0039522在IS下调，其可能通过上调miR-15a-5p、抑制TGF-β信号通路参与白细胞引起的炎症损伤，将来需要在细胞层面进一步明确hsa_circ_0039522在IS病理生理中的分子机制。

综上所述，本研究通过高通量芯片技术探究了IS患者外周血白细胞中circRNA表达的改变，并用qRT-PCR验证了部分差异表达的circRNA。对这些差异表达的circRNA进行了信号通路的探索和GO富集分析，结果表明其可能参与IS相关的TGF-β信号通路，hsa_circ_0039522可能与IS的发生发展有关。但本研究纳入的样本量较小，需要扩大样本再进一步验证。