葛根异黄酮对骨质疏松状态下种植体周围骨结合的影响

孙雨辰，顾永佳，郑荣裕

(上海理工大学附属市东医院口腔科，上海 200438)

口腔种植修复是当前修复失牙的首选方法[1]。口腔种植修复成功的关键在于术后获得良好的种植体-骨界面，即骨结合[2]。骨质疏松是一种全身性骨量减少的疾病[3]，主要表现为骨组织微结构遭到破坏，骨量减少，破骨的速度远大于骨形成速度[4]，我国骨质疏松位于慢性病第3位[5]。多数研究[6]认为因雌激素水平下降，卵巢功能减退，女性患病率远高于男性。为了提高女性患者种植牙的成功率，有必要对绝经后骨质疏松状态下的种植体植入进行深入研究。

葛根异黄酮是中药葛根的主要有效成分，研究[7]表明葛根异黄酮可以增加骨密度，促进骨矿化，具有一定的植物雌激素效应，多用于防治骨质疏松症。而葛根异黄酮对骨质疏松状态下种植体周围骨结合影响的相关报道还十分罕见。

1 材料和方法

1.1 仪器与材料 纯钛种植体(长5 mm，直径2 mm，螺距0.8 mm，九州生物有限公司)；葛根异黄酮80%(陕西森弗生物科技有限公司)；Micro-CT 机(Siemens，德国)；光固化包埋机(EXAKT，德国)；硬组织切片机(EXAKT，德国)；硬组织磨片机(BROT-LAB，法国)；江南XD-202 倒置生物光学显微镜(南京江南永新光学有限公司)；Image-Pro Plus6.0 图像分析软件。

1.2 方法

1.2.1 骨质疏松模型建立及分组 36 只3 月龄、雌性SPF 级SD 大鼠(大连医科大学实验动物中心)，动物伦理编号：2018073。随机抽取6 只为正常组；6 只为假手术组，行双侧卵巢周围等量脂肪摘除术；剩余24 只行双侧卵巢摘除术(卵巢摘除组)，术后连续5 d观察阴道分泌物涂片，术后3 个月正常组、假手术组、卵巢摘除组各随机选取3 只全麻下Micro-CT 观察。确定模型建立成功后，将卵巢摘除组随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组6 只。

1.2.2 种植体植入 术前全麻，于双侧胫骨近心端内侧行1 cm 的纵行切口，钝性分离，暴露骨面，用牙科打磨机，转速＜600 r/min 扩孔，植入直径2 mm 长度5 mm 的纯钛种植体。

1.2.3 动物处理 术后即开始每天灌胃，低剂量组予葛根异黄酮水溶液25 mg/kg，中剂量组予葛根异黄酮水溶液50 mg/kg，高剂量组予葛根异黄酮水溶液100 mg/kg，正常组、假手术组、模型组给予等体积生理盐水。连续灌胃12 周后，处死实验动物，取出带有种植体的胫骨，制备0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的组织块72 块。

1.2.4 观察指标 (1)骨质疏松模型评估：卵巢摘除术后连续5 d 进行阴道分泌物涂片，均未观察到动情周期。术后3 个月，随机取36 块组织块行Micro-CT 拍摄，所得图像进行三维重建，选取种植体周围0.5 mm 的骨组织为感兴趣区域，分析骨体积分数(bone volume fraction around the implant,BV/TV)，观察是否达到骨质疏松状态。(2)组织切片观察：随机36 块组织块，硬组织切片机延钉子长轴切割，Van Gieson 氏苦味酸-酸性品红(VG)染色，于倒置显微镜镜下观察，用Image-Pro Plus6.0 图像分析软件测量骨接触率(bone to implant concntact,BIC)，即种植体表面直接接触的骨长度占种植体表面总长度的百分率。(3)最大拉拔力测试：剩余的36 块标本以2 mm/min的速度沿钉子长轴牵引种植体，以峰值为最大拔出力值。

1.2.5 统计学方法 运用SPSS 22.0 进行统计分析，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 骨质疏松模型鉴定 卵巢摘除术后3 个月，正常组大鼠双侧胫骨近心端的BV/TV 与假手术组比较差异无统计学意义(P=0.511)；模型组BV/TV 较正常组及假手术组显著降低(P＜0.001)(表1)，说明骨质疏松造模成功。与模型组比较，低剂量组大鼠感兴趣区域内的BV/TV 差异无统计学意义(P=0.418)；中、高剂量组感兴趣区域内的BV/TV 显著增加(P=0.006,P＜0.001)(表1)，表明葛根异黄酮可以促进种植体周围骨的形成。

2.2 组织切片观察 种植体植入12 周后，VG 染色示，种植体螺纹周围均有新骨形成，骨小梁被染成红色。正常组与假手术组、低剂量组与模型组骨小梁致密程度无明显差异；模型组骨小梁较正常组及假手术组明显稀疏；中、高剂量组骨小梁较模型组明显致密(图1)。各组BIC 差异有统计学意义(F=54.290,P＜0.001)，正常组与假手术组比较差异无统计学意义(P=0.522)，模型组显著低于正常组及假手术组(P＜0.001)，模型组与低剂量组差异无统计学意义(P=0.250)，中、高剂量组显著增加(P=0.001,P＜0.001)，表明葛根异黄酮可以促进种植体周围骨结合(表1)。

图1 葛根异黄酮对骨质疏松大鼠胫骨近心端种植体周围骨结合的影响(40×)

2.3 各组种植体最大拉拔力 种植体植入12 周后，各组间最大拉拔力比较差异有统计学意义(F=20.015,P＜0.001)，正常组与假手术组间差异无统计学意义(P=0.532)。模型组显著低于正常组及假手术组(P＜0.001)，低剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P=0.204)，中、高剂量组种植体拔出力显著增加(P=0.001，P＜0.001)高剂量组与正常组及假手术组差异无统计学意义(P=0.867,0.429)(表1)。表明葛根异黄酮可以促进种植体周围骨结合，且高剂量组从力学角度上看，已经达到和正常组一样的水平。

表1 各组种植体周围BV/TV、BIC 和最大拉拔力比较(,n=6)

表1 各组种植体周围BV/TV、BIC 和最大拉拔力比较(,n=6)

注：与正常组比较，△P＜0.05；与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

3 讨 论

骨质疏松是一种以骨量减少，骨微结构改变为表现的疾病。颌骨作为全身骨骼的重要部分之一，也受到这种疾病的影响，绝经后女性尤其好发。葛根异黄酮是葛根提取出来的有效物质，其中葛根素属于特效成分[8-9]，葛根素可以提高丝裂原活化蛋白激酶水平，改善骨小梁结构[10]。李斌斌等[11]发现葛根素可以刺激成骨细胞合成分泌碱性磷酸酶。李林芝等[12]发现葛根素可直接抑制破骨细胞骨吸收。葛根异黄酮对骨质疏松动物模型有抗骨质疏松作用[13]。本研究运用葛根异黄酮灌胃旨在研究其对骨质疏松状态下种植体周围骨结合的影响，为提高骨质疏松患者种植修复的成功率提供新的理论依据。

健康的性成熟雌性SD 大鼠，双侧卵巢摘除术后，连续阴道分泌物观察不到动情周期，说明卵巢摘除手术成功。卵巢摘除术后3 个月，正常组与假手术组的BV/TV 没有明显差异，说明卵巢摘除术这一手术方式不会对实验产生影响。模型组与正常组及假手术组相比，BV/TV 显著下降，说明骨质疏松造模成功。

钉子植入12 周后，种植体周围0.5 mm 范围内的BV/TV 和BIC 结果显示，模型组的BV/TV 和BIC显著降低，说明骨质疏松可以抑制种植体周围的新骨形成和骨矿化，种植体与骨的骨结合率下降。低剂量葛根异黄酮(25 mg/kg)组与模型组相比差异无统计学意义，说明低剂量的葛根异黄酮灌胃不能纠正骨质疏松的破骨过程，不能促进种植体周围骨结合。中、高剂量葛根异黄酮(50、100 mg/kg)组与模型组相比，表现为显著增高，说明中、高剂量葛根异黄酮组可使骨质疏松大鼠种植体周围新生骨量增加，加快骨质疏松大鼠种植体周围骨的矿化，但并未达到与正常组及假手术组相同的水平。说明中、高剂量葛根异黄酮灌胃时促进了骨质疏松大鼠种植体周围骨结合，但是从微观的角度看并未达到与正常组相似的水平。

最大拉拔力是反映骨结合的一种有效方式。种植体植入12 周后，模型组与正常组及假手术组相比显著降低，说明骨质疏松大鼠种植体周围骨结合的效果不佳。低剂量组与模型组相比差异无统计学意义，说明低剂量葛根异黄酮灌胃时也不能有效地改善骨质疏松大鼠种植体周围骨结合的情况。中、高剂量组与模型组相比，最大拉拔力均明显增大，说明中、高剂量葛根异黄酮灌胃可以促进骨质疏松大鼠种植体周围骨结合。且高剂量葛根异黄酮组与正常组及假手术组相比差异无统计学意义，说明高剂量葛根异黄酮灌胃时，可以促进骨质疏松大鼠种植体周围骨结合，且可达到与正常组相似的水平。

综上所述，双侧卵巢摘除术是一种比较稳定的骨质疏松造模方法；骨质疏松影响种植体周围骨结合；葛根异黄酮灌胃可促进种植体周围骨结合，低剂量灌胃时没有明显效果，中、高剂量灌胃时可以达到促进种植体周围新骨形成和骨矿化的目的，且从力学角度评判骨结合的时候，高剂量葛根异黄酮灌胃时，可以达到与正常组及假手术组相似的效果。