应用Nissl/GFAP 荧光标记流式细胞术检测神经干细胞分化的研究*

秦建兵，李 雯，单伯权，何 辉，金国华*

(南通大学医学院人体解剖学系，南通 226001)

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是中枢神经系统中具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多向分化潜能的细胞[1]。如何诱导NSCs更多地向神经元或特定表型神经元分化，在NSCs 经不同因素诱导其分化后，如何快速准确地计数NSCs诱导分化后的神经元和胶质细胞的数量及比例已成为当今生命科学领域的热门研究[2-3]，本研究为NSCs的研究提供一个新的实验方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 SD 大鼠及孕鼠(南通大学实验动物中心)、NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂(Thermo)、豚鼠抗神经元核心抗原(neuronal nuclei,NeuN)多克隆抗体(Merck)、山羊抗豚鼠IgG(Ivitrogen)、Alexa 647 标记胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)单克隆抗体(BD)、DMEM/F12 培养基(Corning)、胎牛血清、胰酶(Gibco)、20×磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered solution,PBS)(上海生工生物)、智能油型激光共聚焦显微镜(Olympus FV10I)、流式细胞仪(BD FACS Calibur)。

1.2 大鼠灌注、固定、取材、冰冻切片 取成年SD大鼠，麻醉后经心脏生理盐水冲洗后用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS)灌注固定，取脊髓组织后固定，20%蔗糖脱水沉底后行冰冻切片，纵向片厚25 μm，粘贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片。实验方案通过南通大学实验动物中心动物伦理原则(S20210424-005)。

1.3 大鼠NSCs 培养及诱导分化 参照王珊珊等[4]的方法提取和诱导NSCs 分化，孕15 d SD 大鼠腹腔麻醉后无菌条件下取胚胎置无血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)中，剔除脑膜，分离海马组织，用机械法将组织制成单细胞悬液，用增殖培养液[DMEM/F12，2%B27，20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，20 μg/L 表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)]重悬，经孔径40 μm的筛网过滤后，种植于T25 培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将第0 代(passage 0,P0)神经球消化成单细胞传代，再将第1 代(passage 1,P1)神经球消化，以密度2×104细胞/cm2种植于24 孔、6 孔培养板中，加入分化培养液(DMEM/F12,2% FBS) 贴壁分化3 d 后观察分化结果。

1.4 NeuN 免疫荧光及Nissl 荧光染色 0.01 mol/L PBS 清洗切片3 遍入含10%山羊血清封闭1 h，去除封闭液，豚鼠抗NeuN 多克隆抗体4 ℃孵育过夜，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍后滴加山羊抗豚鼠IgG室温2 h，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍，滴入NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂和Hoechst33342 室温孵育20 min，0.01 mol/L PBS 清洗3 遍，盖上盖玻片，共聚焦显微镜观察。

1.5 GFAP 免疫荧光及Nissl 荧光标记细胞滴片观察及流式细胞术检测 将NSCs 诱导分化后的细胞悬液封闭液室温封闭15 min，1 000 r/min 离心5 min，去除封闭液后加入Alexa 647 标记的GFAP 单克隆抗体室温孵育1 h，1 000 r/min 离心5 min，破膜清洗液洗2 遍后加NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂室温孵育10 min，去除染液，用0.1 mol/L PBS 0.5 mL 重悬细胞，取50 μL 滴在载玻片上盖上盖玻片，共聚焦显微镜观察，其余用于流式细胞术上样。

2 结 果

2.1 体内NeuN 免疫荧光和Nissl 荧光染色 由图1(见封二)可见，NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂，除了特异性结合大鼠脊髓NeuN 阳性神经元胞质中的尼氏小体外，亦能与嗜碱性的细胞核结合，所以神经元的胞质和胞核均被标记为红色，而NeuN阴性的胶质细胞仅有胞核标记为红色。

图1 大鼠脊髓纵向切片NeuN 免疫荧光及Nissl 荧光染色

2.2 NSCs 体外诱导分化后NeuN 免疫荧光和Nissl荧光染色 由图2(见封二)可见，体外实验的观察与体内一致，NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂对诱导分化为NeuN 阳性的神经元胞质中的尼氏小体和胞核均标记红色荧光，而NeuN 阴性的胶质细胞仅有细胞核标记红色。

图2 大鼠NSCs 诱导分化3 d 后NeuN 免疫荧光及Nissl 荧光染色

2.3 NSCs 体外诱导分化后细胞悬液GFAP 免疫荧光和Nissl 荧光染色细胞滴片 由图3(见封二)可见，NSCs 经体外诱导分化3 d 后，经两种荧光共标记，神经元胞质中的尼氏小体及细胞核均被Neuro－Trance Nissl 530/615 红色荧光染色剂标记为红色，而GFAP 阳性的星形胶质细胞胞质被标记为蓝色，只有细胞核标记成红色。因此，细胞经流式细胞术检测时，通过红色荧光信号的高度和面积，可将神经元与胶质细胞区分开。

图3 大鼠NSCs 诱导分化3 d 后细胞悬液滴片GFAP 免疫荧光及Nissl 荧光染色

2.4 NSCs 体外诱导分化后细胞流式分析 NSCs 经体外诱导分化3 d 后，流式细胞术通过收集细胞的散点图(图4A,见封二)分析，用Nissl 单标记荧光信号的高度或面积与前向散射光散点图(图4B、E,见封二)，或Nissl 单标记的直方图(图4C,见封二)均见Nissl阳性细胞群与阴性细胞靠的比较近，对分析结果的判断可因圈门的差异带来人为的误差。而采用Nissl 与GFAP 两个荧光通道的散点图(图4D、F,见封二)分析，结果发现无论用Nissl 信号的高度还是面积分析，均能完全清晰地将NSCs 经诱导分化为神经元的细胞群体展示出来，两种方法对分析结果的差异性不大。

图4 大鼠NSCs 诱导分化3 d 后细胞悬液GFAP 免疫荧光及Nissl 荧光染色结果流式分析图

3 讨 论

NSCs 移植后，部分环路和功能的重建是修复和代替受损脑组织的有效途径，已被广泛地用于神经退行性疾病(如阿尔兹海默病、帕金森病等)、卒中、脊髓损伤及中枢神经系统遗传疾病等动物模型或临床的治疗研究，且取得了较好的效果[5]。在自然条件下，NSCs 主要分化为星形胶质细胞，因此如何促进NSCs 更多地向神经元分化则是研究者的兴趣所在，他们通过微环境和细胞因子等研究NSCs 分化的机制，来探讨如何诱导NSCs 更多地向神经元分化。

诱导NSCs 分化后的细胞类型鉴定目前常用的有免疫荧光、Western Blot、实时定量聚合酶链式反应及流式细胞术等[6-10]，大部分学者都采用免疫荧光染色后显微镜观察、图像处理计数来实现，但由于实验样本的量及图像处理统计的手段容易导致实验的繁杂和误差的产生。流式细胞术样品是将组织或细胞的整体细胞悬液样本进行上机检测，避免了免疫荧光图片人工选取视野的抽样误差。但细胞标志物的选择是流式细胞术检测的难题，由于还没有发现用于神经元检测的细胞表面标志物，只能通过固定、破膜后检测细胞胞质中不同类型细胞的特异性标志物，由于这些标志物表达的时间和表达量的不同，给检测带来困难，造成诸如阳性细胞群体与阴性细胞群体不能完全区分开等，从而导致实验结果的误差。因此，寻找快速准确的计数NSCs 诱导分化后的神经元和胶质细胞数量及比例的方法显得十分必要。

尼氏染色[11-12]是一种标准组织学方法，用于显示脑和脊髓中的神经元。尼氏小体是神经元胞体或树突内特有的大的嗜碱性团块和颗粒，又名“嗜染质”，为F.NISSL 1892 年首次发现，由发达的粗面内质网和游离核糖体构成，具有合成更新细胞器所需的结构蛋白、神经递质所需的酶类以及肽类的神经调质功能，其形状、数量和分布随不同的神经元而异。NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂对神经元特有的Nissl 物质具有选择性，比甲苯胺蓝或甲酚紫等传统组织学染料更灵敏。本研究表明，在体内、外实验中，NeuroTrace 530/615 红色荧光染色剂均能明显区分出神经元和胶质细胞，神经元的胞体和核被红色荧光标记，而胶质细胞只能标记酸性的细胞核。流式细胞术分析发现，仅通过分析尼氏染色红色荧光通道，是不能完全将神经元细胞群与胶质细胞群分开的。而加上星形胶质细胞的特异性标志物GFAP 后，通过尼氏染色红色荧光通道和GFAP 蓝色荧光通道的散点图，能完全地将神经元细胞群和星形胶质细胞群区分开来，而且在阳性的神经元细胞群下方还观察到可能是少突胶质细胞或未分化细胞的细胞群。此实验方法简便易行，图像展示结果清晰，数据分析结果可靠，可提供NSCs 研究者选用。