黄芪甲苷纳米胶束的制备及Caco-2单层细胞转运研究

黄昭峰,徐 丽

1.南京市溧水区人民医院药剂科,南京 211200;2.南京市溧水区永阳街道社区卫生服务中心,南京 211200

黄芪甲苷（astragelosideⅣ,AST）是从黄芪中提取的一种皂苷类化合物,具有调节机体免疫力、增强机体抗病能力的功效[1]。AST 在水中溶解性较差,且是P糖蛋白（P-gp）的底物[2],口服生物利用度仅为7.4%[3]。本研究以聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic F127）和聚乙二醇1000 维生素E琥珀酸酯（TPGS）作为载体材料[4],通过冷冻干燥-水化法将AST 制备成纳米胶束（AST-NMs）,并通过Caco-2 单层细胞转运实验评价其体外渗透性,为AST 的口服新剂型研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

K2025高效液相色谱仪（海能未来技术集团股份有限公司）;SY18-1油浴水浴磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）;Pilot10-15S真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）;Zetasizer Ultra纳米粒度电位仪（英国马尔文公司）;JEM-2100透射电子显微镜（日本电子公司）;Herocell 240二氧化碳培养箱（上海润度生物科技有限公司）。

1.2 试药

黄芪甲苷（上海源叶生物科技有限公司,质量分数为99.0%,批号S1902214）;聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic F127,南京威尔药业集团股份有限公司）;聚乙二醇1000 维生素E 琥珀酸酯（TPGS,德国巴斯夫公司）;叔丁醇（济南金永硕化工有限公司）;蒸馏水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 AST-NMs的制备

通过冷冻干燥-水化法[5]制备AST-NMs。按照处方比例称取Pluronic F127和TPGS共10 g溶解到100 mL叔丁醇中,再按照比例称取AST加入到上述溶液中,搅拌直至药物完全溶解;将液体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥,收集干燥后的固体块状物,研碎,密封保存;称取固体粉末5 g,置于烧杯中,加入蒸馏水100 mL（水温为50℃）,在1 000 r·min-1磁力搅拌下水化固体粉末,保持50℃水温持续搅拌30 min;将溶液冷却至室温,加水定容至100 mL,溶液经0.22μm 微孔滤膜过滤,去除不溶性药物,即得到AST-NMs,4～8℃储存,备用。

2.2 包封率测定

取AST-NMs溶液1.0 mL,置于50 mL 量瓶中,加入甲醇,超声破坏胶束,再加入流动相定容,得到待测液。样品经高效液相色谱-蒸发光检测器（HPLCELSD）法检测药物含量,色谱条件[6]:Hypersil BDS C18色谱柱（150 mm,4.6 mm×5μm）,流速为1.0 mL·min-1,进样量为20μL,流动相为甲醇-水（75∶25）,柱温为35℃,蒸发光散射检测器（ELSD）参数:漂移管温度为60℃,空气流速为200 kPa。根据公式计算包封率。所有样品均测定3次,取平均值。

包封率（%）=W0÷W1×100%,其中,W0表示包载到纳米胶束中的药物量,W1表示投药量。

2.3 粒径分布测定

取AST-NMs约200μL 加入到样品池中,加入适量去离子水稀释,摇匀,通过纳米粒度电位仪测定粒径分布,设置散射角为173°,波长为633 nm,样品测定前需在25℃条件下平衡3 min。每份样品平行测量3次,取平均值。

2.4 实验设计优化处方

采用中心复合实验设计考察Pluronic F127 与TPGS质量比（X1）和聚合物与药物质量比（X2）2个变量对AST-NMs包封率（Y1）和粒径分布（Y2）的影响,共进行了11次实验,实验结果见表1。

表1 实验设计及结果Tab.1 Results of central composite design

表2 包封率（Y1）方差分析结果Tab.2 The ANOVA of encapsulation efficiency（Y1）

表3 粒径分布（Y2）方差分析结果Tab.3 The ANOVA of particle size distribution（Y2）

通过响应面图可进一步直观分析Pluronic F127与TPGS质量比（X1）和聚合物与药物质量比（X2）对AST-NMs包封率（Y1）和粒径分布（Y2）的影响。见图1和图2。由图1可知,随着X1和X2的增加,包封率（Y1）均出现增加趋势;由图2 可知,随着X1和X2的增加,粒径分布（Y2）均出现减小趋势。

图1 Pluronic F127与TPGS质量比（X1）和聚合物与药物质量比（X2）对AST-NMs包封率（Y1）的响应面图Fig.1 Response surface plot of the influence of the ratio of Pluronic F127 to TPGS （X1）and the ratio polymer to drug（X2）on the encapsulation efficiency（Y1）of AST-NMs

图2 Pluronic F127与TPGS质量比（X1）和聚合物与药物质量比（X2）对AST-NMs粒径分布（Y2）的响应面图Fig.2 Response surface plot of the influence of the ratio of Pluronic F127 to TPGS（X1）and the ratio polymer to drug（X2）on the particle size distribution（Y2）of AST-NMs

本研究要求制备的AST-NMs的包封率最大化,粒径分布最小化,经实验软件预测得到AST-NMs的最优处方为:Pluronic F127与TPGS质量比为5∶1,聚合物与药物质量比为38∶1,预测AST-NMs的包封率为98.7%,粒径为35.0 nm。按照该处方制备3批AST-NMs,测定包封率为98.4%±1.5%,粒径为（36.4±2.3）nm,与预测值较接近。

2.5 AST-NMs表征

2.5.1 DSC分析 通过DSC 分析AST 原料药、TPGS、Pluronic F127、AST 原料药与聚合物的物理混合物以及AST-NMs冻干粉,以确定AST在胶束中的存在形式。精密称取上述5种样品置于带盖的铝锅中,密封,在20℃～340℃范围内以10℃·min-1的加热速率进行分析,结果见图3。

图3 差示扫描量热图Fig.3 Differential scanning calorimetry

由图3可知,AST 原料药的吸热峰约为296℃,TPGS和Pluronic F127分别约在46、34℃处出现吸热峰,物理混合物中AST 约在296℃处出现吸热峰,表明AST 以结晶态形式存在;AST-NMs的冻干粉中药物吸热峰消失,表明AST 为无定形态,药物很可能以分子形式分散在聚合物中[7]。

2.5.2 微观形态观察 取1滴AST-NMs滴加到碳包覆的铜网格上,铺展后用滤纸吸干多余液体,再滴加1滴磷钨酸钠溶液（2 mg·mL-1）,负染色5 min,室温下干燥,通过透射电镜在120.0 kV 加速电压下观察AST-NMs的微观形态,见图4。电镜照片显示,AST-NMs呈圆整的球状,未发现聚集以及药物结晶,粒径大小在20～40 nm 范围内分布,与纳米粒度仪测量的结果相似。

图4 AST-NMs的透射电镜照片Fig.4 Transmission electron micrograph of AST-NMs

2.6 稀释稳定性评价

胶束进入人体胃肠道中会被稀释,存在药物泄露的风险,因此需要通过体外稀释实验考察其稀释稳定性[8]。采用pH1.2 盐酸溶液、pH4.5 枸橼酸溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）以及pH7.4 PBS分别将AST-NMs稀释200倍,在37℃水浴中恒温保存,分别在0、2、4、6 h时间点观察外观,并取样测定粒径分布。每份样品平行实验3次,取平均值,结果见表4。

表4 AST-NMs稀释稳定性结果 （n=3,）Tab.4 The dilution stability of AST-NMs （n=3,）

表4 AST-NMs稀释稳定性结果 （n=3,）Tab.4 The dilution stability of AST-NMs （n=3,）

稀释稳定性结果显示,AST-NMs经不同pH 溶液稀释,在考察的时间范围内未出现絮凝分层以及药物析出沉淀现象;样品在放置过程中粒径未发生显著变化,说明AST-NMs经不同pH 溶液稀释后稳定性良好,预示着AST-NMs在胃肠道内会长时间以完整的纳米胶束形式存在,并最终进入体循环[9]。

2.7 体外药物释放

采用透析法评价AST-NMs的体外药物释放情况[10]。将AST-NMs 5 mL 置于处理好的透析袋中（截留相对分子质量为8～10 k Da）,系紧两端,将样品分别完全浸入pH1.2盐酸溶液、pH4.5枸橼酸溶液、pH6.8PBS以及pH7.4PBS（释放介质中均含有质量浓度为5 mg·mL-1吐温-80溶液）中,体积为245 mL,温度为37℃,磁力搅拌速度为50 r·min-1,分别在固定的时间点（1、2、4、6、8、10、12、24 h）取出介质溶液5 mL,并补加对应的等体积空白释放介质,上述释放介质溶液经0.22μm 微孔滤膜过滤,稀释适当倍数,HPLC-ELSD法检测药物含量,计算累积释放度。见图5。

图5 AST-NMs在不同pH介质中的体外药物释放曲线 （n=6,）Fig.5 In vitro drug release curves of AST-NMs in different pH media （n=6,）

由图5可知,AST-NMs在不同pH 释放介质中药物释放速率基本一致,说明介质pH 不会对药物释放产生影响。在最初的2 h从AST-NMs释放了约15%的药物,后期药物释放较为缓慢,24 h后药物释放量约为60%。

2.8 Caco-2细胞单层渗透性研究

将生长状态良好的密度为1.0×104个·mL-1的Caco-2细胞接种于Transwell 24孔微孔滤膜培养板上,加入培养基并在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养,每隔48 h更换培养基,培养21 d后去除培养基,测量跨上皮电阻（TEER）值大于600Ω·cm-2,说明Caco-2细胞已经形成了完整和紧密的单细胞层[11],可用于转运实验。实验开始时,Caco-2细胞单层用预热（37℃）的空白汉克平衡盐溶液（HBSS）洗涤3次。从顶端（AP）到基底外侧（BL）转运实验操作如下:将AST溶液或AST-NMs（药物质量浓度均为0.5 mg·mL-1）各0.5 mL添加到AP表面作为供给池,将HBSS（pH 7.4）1.5 mL添加到BL表面作为接收池;同样,从基底外侧（BL）到顶端（AP）转运实验操作如下:将AST 溶液或AST-NMs（药物质量浓度均为0.5 mg·mL-1）各1.5 mL添加到BL表面作为供给池,将HBSS（pH 7.4）0.5 mL 添加到AP 表面作为接收池,分别在60、120、180和240 min从接收池中取出200μL 样品溶液（同时补充等量的空白HBSS）,检测药物含量,按照下列公式计算表观渗透系数（Papp）。每组实验平行进行3次,取平均值。

其中d Q÷dt为单位时间内药物转运量,A 为转运膜面积,C0为供给液中药物的初始质量浓度,Papp（AP-BL）为药物从AP 侧到BL 侧的表观渗透率,Papp（BL-AP）为药物从BL侧到AP侧的表观渗透率。见表5。

表5 AST和AST-NMs在Caco-2细胞单层中的Papp 值 （n=3,）Tab.5 Apparent permeability c oefficients of AST and ASTNMs in Caco-2 cell monolayer（n=3,）

表5 AST和AST-NMs在Caco-2细胞单层中的Papp 值 （n=3,）Tab.5 Apparent permeability c oefficients of AST and ASTNMs in Caco-2 cell monolayer（n=3,）

实验结果表明,AST 原料药从AP侧转运至BL侧,其Papp（AP-BL）值为（3.7±0.5）×10-6cm·s-1,从BL侧转运至AP侧,其Papp（BL-AP）值为（9.6±0.6）×10-6cm·s-1,说明Caco-2单层细胞对AST 存在外排作用,AST 很可能是P-gp的底物[2];AST-NMs从AP侧转运至BL侧,其Papp（AP-BL）值为（5.3±0.3）×10-6cm·s-1,从BL侧转运至AP侧,其Papp（BL-AP）值为（4.2±0.4）×10-6cm·s-1,与AST 原料药相比,AST-NMs明显增加了药物吸收,抑制了药物外排,一方面是由于AST-NMs可通过胞饮作用被小肠上皮细胞吸收,减弱了肝脏首过效应[12],另一方面是由于AST-NMs中的TPGS可抑制P-gp的活性,减弱了其对AST 的外排作用[13]。

3 讨论

研究表明,NMs可通过胞饮作用被完整地吸收到体循环中,其粒径大小会影响吸收的速率和程度,粒径小于10 nm 的纳米胶束可以被肾脏过滤除掉,而大于100 nm 的纳米胶束可以逃避内皮网状系统（RES）识别,易被肝脏捕获,实现体内的长循环作用[14],因此,纳米胶束较为理想的粒径在10～100 nm 范围。本研究制备的AST-NMs粒径在20～40 nm 之间,有利于逃避RES的识别并延长体内药物作用时间。

P-gp是细胞膜中的主要转运蛋白,它的功能是泵出有毒的外源性物质,维持机体正常生理功能[15],小肠上皮细胞中存在大量的P-gp,可能影响到部分药物吸收[16]。TPGS是一种安全的表面活性剂,能抑制P-gp的活性[17]。因此,AST-NMs的处方中加入TPGS。Caco-2单层细胞渗透性实验表明,ASTNMs能够促进药物吸收,减少药物外排。通过本研究结果可以推测采用Pluronic F127和TPGS制备的纳米胶束可以增大黄芪甲苷的口服生物利用度。