肾康丸对糖尿病肾病大鼠肾功能、胰岛素抵抗的影响

黄乔木,何 艳

1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院肾内科,咸宁 437000;2.咸宁市第一人民医院重症医学科 咸宁 437000

研究表明,影响肾功能的因素主要有糖尿病、高血压、家族遗传等,其中对肾功能影响较大的是糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）[1-2]。早期糖尿病主要影响肾脏入球小动脉及邻近的血管,随着病程进展,血流动力学特征逐渐转化为高阻、低流速和低灌注[3]。足细胞是一种肾小囊脏层上皮细胞,该类细胞是经过高度分化的特异性细胞,可参与维持肾小球滤过屏障功能、调节超滤系数和稳定肾小球毛细血管等[4-5]。肾康丸是一种纯中药制剂,可用于治疗慢性肾炎和慢性肾功能衰竭等,可以消除尿蛋白和潜血,同时能稳定降低血肌酐和尿素氮等毒素物质的水平,保护肾功能,延缓慢性肾功能衰竭的进展[6]。本文旨在研究肾康丸对DN 大鼠肾功能、胰岛素抵抗和足细胞的影响,以期了解肾康丸保护DN 大鼠的作用机制,从而为DN 的治疗提供一定的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

聚合酶链反应（PCR）扩增仪（美国Sigma 公司）;透射电镜（日本JEOL公司）;ONETOUCHⅡ血糖仪及血糖试纸均购自美国强生公司。

1.2 试药

肾康丸（批号为20181210,主要由黄芪、金樱子、蝉蜕、益母草、水蛭和玉米须等制成,咸宁市中心医院药剂科;链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）、Trizol柱纯化总RNA试剂盒均购自美国Sigma公司;一抗及二抗、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量试剂盒均购自美国Abcam 公司。

1.3 动物

SPF级雌性SD 大鼠30 只,6～8 周龄,体 质量（200±30）g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号SCXK（京）2017-0022,分6个笼子饲养,每个笼子5只。饲养于医院动物中心实验室。

2 方法

2.1 建立DN 大鼠模型

参照文献[7]构建DN大鼠模型。给予高糖和高脂肪饲料喂养1个月,禁食12 h后腹腔注射25 mg·kg-1STZ。1周后,若STZ注射后连续3d血糖≥16.7 mmol·L-1,尿量＞原尿量150%,尿糖为（+++～++++）,即可判断糖尿病大鼠模型构建成功。继续以高糖和高脂肪饲料喂养3个月,当尿蛋白排泄量＞30 mg·d-1,则可认为DN 模型建立成功。

2.2 分组及药物干预

将30只大鼠分成3组,每组10只。第1组为正常大鼠;第2组为建模组,即DN 模型组;第3组为肾康丸治疗组,按大鼠（200 g）与成人（70 kg）的体质量比,计算大鼠的等效剂量。将肾康丸成药经研磨后用蒸馏水配成质量浓度为350 mg·mL-1的溶液,每日灌液1 mL,模型组灌注等量的生理盐水。若有死亡的小鼠及时补上。

2.3 检测项目

2.3.1 大鼠左肾质量、血清肌酐、尿素氮和微量尿蛋白的检测 处理结束后,称定大鼠体质量,并收集24 h尿液,检测微量尿蛋白,腹主动脉取血分离上清检测血清肌酐和尿素氮含量,处死大鼠后迅速解剖肾脏组织,并称取左肾质量,计算左肾质量与体质量的比值。

2.3.2 血清胰岛素和血糖的测定及胰岛素抵抗指数的计算 取大鼠腹主动脉血,使用125I-胰岛素放射免疫法检测胰岛素含量,使用ONETOUCHⅡ血糖仪检测大鼠静脉血糖。胰岛素抵抗指数=（空腹血糖水平×空腹胰岛素水平）/22.5。每个实验重复3次,每组做3次平行实验,最后将结果取平均值。

2.3.3 大鼠血清总胆固醇和三酰甘油水平的检测取大鼠血清,按照试剂盒的说明书操作,检测血清总胆固醇（total cholesterol,TC）和三酰甘油（triglyceride,TG）的含量。

2.3.4 荧光定量PCR 检测肾组织足细胞裂隙跨膜基因nephrin和肌间线蛋白m RNA 水平 取适量肾组织,用Trizol试剂提取总RNA,逆转录合成cDNA模板链,再进行荧光定量PCR 扩增,以三磷酸-甘油醛脱氢酶为内参,计算肌间线蛋白（desmin）和nephrin mRNA 的相对表达水平。

2.3.5 蛋白印迹检测肾组织desmin和nephrin蛋白的表达水平 取适量肾组织,添加蛋白裂解液提取总蛋白,检测浓度后取50μg蛋白进行凝胶电泳,待蛋白完全分离后,电转至聚偏氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜,将PVDF 膜置于脱脂牛奶中,室温下孵育2 h,封闭非特异性位点,再于4℃下分别孵育desmin、nephrin和β肌动蛋白（β-actin）蛋白一抗过夜,清洗后在室温下孵育蛋白二抗1 h,最后添加电化学发光法（electro-chemi-luminescence,ECL）发光试剂进行蛋白显影。以β-actin为内参,计算desmin和nephrin蛋白的相对表达量。

2.3.6 透射电镜观察足细胞的超微结构 将肾组织固定于戊二醇溶液中,制成石蜡切片,置于醋酸铀染液中染色20 min,再置于柠檬酸铝染液中染色15 min,用透射电镜观察足细胞超微结构的变化。

2.4 统计学方法

用SPSS18.0软件对数据进行处理和分析,数据以均数±标准差表示,多组均数采用单因素方差分析,组间两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肾康丸对大鼠肾脏质量和肾功能的影响

与正常组相比,DN 模型组大鼠左肾质量/体质量、血肌酐和尿素氮水平有显著的提高（P＜0.05）;与DN 模型组相比,肾康丸治疗组血肌酐和尿素氮水平显著降低（P＜0.05）,但肾康丸治疗组与DN 模型组左肾质量/体质量比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 肾康丸对大鼠肾脏质量和肾功能的影响 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

表1 肾康丸对大鼠肾脏质量和肾功能的影响 （,n=10）Tab.1 Effects of Shenkang Pills on renal weight and function in rats（,n=10）

注:与正常组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05。

3.2 肾康丸对大鼠血糖及胰岛素的影响

与正常组相比,DN 模型组大鼠血糖和胰岛素抵抗指数显著升高,胰岛素含量显著降低（P＜0.05）;与DN模型组比较,肾康丸治疗组大鼠的血糖和胰岛素抵抗指数显著降低,胰岛素含量显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 肾康丸对大鼠血糖及胰岛素的影响 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

表2 肾康丸对大鼠血糖及胰岛素的影响 （,n=10）Tab.2 Effects of Shenkang Pills on blood glucose and insulin in rats （,n=10）

注:与正常组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05。

3.3 肾康丸对大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影响

与正常组相比,DN 模型组大鼠TG、TC 和微量尿蛋白水平显著升高（P＜0.05）;与DN 模型组相比,肾康丸治疗组大鼠TG、TC和微量尿蛋白水平显著降低（P＜0.05）。结果见表3。

表3 肾康丸对大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影响（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

表3 肾康丸对大鼠血清TG、TC 和微量尿蛋白含量的影响（,n=10）Tab.3 Effects of Shenkang Pills on levels of serum TG,TC and microalbuminuria in rats （,n=10）

注:与正常组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05。

3.4 肾康丸对大鼠desmin、nephrin蛋白及m RNA表达水平的影响

与正常组相比,DN 模型组大鼠肾组织desmin蛋白及m RNA 的表达上调,nephrin蛋白及mRNA的表达下调（P＜0.05）;与DN模型组相比,肾康丸治疗组desmin蛋白及mRNA 的表达下调,nephrin蛋白及mRNA的表达上调（P＜0.05）。结果见图1、表4。

图1 蛋白印迹检测desmin、nephrin蛋白的表达水平Fig.1 Expressions of desmin and nephrin proteins detected by Western blot

表4 肾康丸对大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表达的影响 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

表4 肾康丸对大鼠desmin、nephrin蛋白及mRNA表达的影响 （,n=10）Tab.4 Effects of Shenkang Pills on desmin,protein and m RNA of nephrin in rats（,n=10）

注:与正常组比较,*P＜0.05;与模型组比较,#P＜0.05。

3.5 肾康丸对大鼠足细胞的影响

肾康丸对大鼠足细胞的影响见图2。由图2 可见,正常组大鼠肾小球基底膜清晰,厚度均匀,足突清晰且排列整齐,无融合现象;DN 模型组大鼠肾小球基底膜明显增厚,厚度不一,足突排列不整齐,且融合现象明显,足突数量减少;与DN 模型组比较,肾康丸治疗组上述肾小球基底膜增厚、足突排列不整齐和融合及数量减少等现象明显减轻。

图2 透射电镜观察大鼠足细胞Fig.2 Observation of rat podocytes by transmission electron microscope

4 讨论

糖尿病患者由于血糖升高,糖基化的终末期产物明显增多,自由基也明显增多,使机体发生氧化应激,造成肾脏损伤。同时,这些自由基还可促进免疫反应和炎症反应,使糖尿病患者血清中的肌酐和尿素氮增多,血压升高,进一步损伤血管内皮,形成恶性循环,这也是导致糖尿病患者病情不断加重的原因之一[8-9]。因此,抗氧化对于预防和延缓糖尿病慢性并发症的发生有重要作用。据报道,用STZ 处理糖尿病大鼠可使其血糖浓度升高,血清中的胰岛素含量下降,同时会引起血压升高、体质量减小、尿蛋白中肌酐和血肌酐含量均上升等症状[10]。本实验中肾康丸处理显著降低了糖尿病肾病大鼠TG、TC、血肌酐和尿素氮含量,有效缓解了肾脏压力,起到改善肾功能的作用。

足细胞存在多种细胞体、主突和足突,其功能和结构也不相同,足细胞的足突之间由极薄的裂孔隔膜相连,这种相连的裂孔隔膜和肾小球内皮细胞共同构成肾小球选择性的分子筛[11]。desmin于1977年被发现,是成熟肾小管上皮细胞的主要标志性结构蛋白之一[12]。研究表明,正常情况下,desmin 在肾小球系膜细胞中的表达量较低,在足细胞中无明显表达;足细胞受到损伤后,desmin可大量表达,主要原因是足细胞的细胞骨架重新排列[13-14]。因此,desmin可作为评估足细胞是否受损的重要指标。本实验中,经过肾康丸处理的大鼠desmin蛋白及mRNA 的表达量显著降低,表明肾康丸可明显改善DN 大鼠足细胞损伤。nephrin是于肾小球裂孔膜上发现的第一个跨膜蛋白,其表达水平下降会使足细胞及裂孔隔膜的结构和功能发生损伤[15-16]。于梅等[17]报道,对DN 患者进行肾活检发现nephrin m RNA 的表达水平下降,且其表达水平与蛋白尿程度呈负相关。大量基础研究发现,足细胞损伤后进行药物干预后,可通过增高肾组织氧化应激和上调nephrin的表达水平而延缓肾小球足细胞损害,且干预后足细胞数量显著增多[18-20]。本研究中,经过肾康丸处理的大鼠nephrin蛋白及m RNA 的表达水平显著上升,说明肾康丸对肾组织中nephrin的表达有一定调节作用,能够起到减轻足细胞损伤、发挥改善DN 的作用。

综上所述,肾康丸可缓解DN 大鼠胰岛素抵抗,改善肾足细胞超微结构,减轻足细胞的减少与融合,发挥保护肾功能的作用。但因肾康丸是一种中药制剂,其中的成分并不是单一的,且仅研究药物剂量相对单一,在后续的实验中可以提取肾康丸中的不同成分,进一步探讨各种成分对肾功能及足细胞的保护机制。